鹅去氧胆酸通过降低SMAD2/3蛋白减轻小鼠精密切割肾切片中的肾纤维化

《Toxicology in Vitro》：The bile acid chenodeoxycholic acid attenuates renal fibrosis in mouse precision-cut kidney slices

　　

摘要：全球超过6700万人患有慢性肾脏病（CKD），其关键病理特征为肾纤维化，但目前尚无获批的抗纤维化疗法。胆汁酸受体法尼醇X受体（FXR）和G蛋白偶联胆汁酸受体1（TGR5）被认为是潜在治疗靶点，但既往研究多依赖动物模型或单细胞培养。本研究采用小鼠精密切割肾切片（mPCKS）这一离体模型，旨在验证FXR与TGR5激活的抗纤维化效应是否同样存在于mPCKS中。结果显示，石胆酸（LCA）诱导了mPCKS的凋亡，而鹅去氧胆酸（CDCA）则未影响组织活力。CDCA处理显著降低了培养诱导及转化生长因子-β（TGF-β）诱导的胶原蛋白I型α1链（Col1a1）和纤连蛋白（Fn1）基因表达及纤连蛋白蛋白水平，同时减少了总SMAD2/3及其磷酸化形式（pSMAD2/3）的表达，但未改变pSMAD2/3与总SMAD2/3的比例。使用FXR拮抗剂DY268和TGR5拮抗剂SBI-115进行阻断后，CDCA仍能抑制TGF-β诱导的纤维化，表明其抗纤维化作用不依赖于FXR或TGR5信号通路。综上，mPCKS是研究肾纤维化中胆汁酸信号传导的生理学相关离体模型，CDCA通过降低SMAD2/3蛋白水平发挥抗纤维化效应，且该作用独立于FXR和TGR5。

研究背景与科学问题

慢性肾脏病（CKD）影响着全球超过6700万人口，且随着老龄化、糖尿病和高血压的流行趋势持续增长。肾纤维化作为CKD的核心病理特征，表现为细胞外基质过度沉积并逐渐取代功能性肾组织，最终可能导致终末期肾病，患者需依赖透析或肾移植维持生命。然而，目前临床上尚无获批的特异性抗肾纤维化疗法。近年来，胆汁酸受体法尼醇X受体（FXR）和G蛋白偶联胆汁酸受体5（TGR5）被确认为潜在的治疗靶点。FXR是一种主要在肝脏和回肠表达的核受体，参与调控胆汁酸合成与转运以及脂质和葡萄糖代谢；其在肾脏也有中等程度表达，参与水重吸收和胆汁酸清除。FXR最有效的内源性配体是鹅去氧胆酸（CDCA）。TGR5是一种膜结合受体，广泛分布于肝、肠和肾等多种组织，激活后可促进能量消耗、刺激胰高血糖素样肽-1（GLP-1）分泌以调节血糖，并抑制炎症反应；其最强激动剂为石胆酸（LCA）。已有研究表明，CKD患者肾脏中FXR和TGR5表达下降，而在多种小鼠模型（如糖尿病肾病、单侧输尿管梗阻（UUO）和急性肾损伤（AKI））中激活FXR或TGR5均能减轻纤维化。然而，这些研究主要基于动物模型或单细胞培养体系：动物模型中全身性因素（如代谢、血流和免疫反应）使得研究肾脏特异性药物效应较为困难；单细胞培养则缺乏定义肾纤维化的复杂多细胞相互作用，限制了其生理相关性。为克服上述局限，研究人员采用了小鼠精密切割肾切片（mPCKS）这一离体模型，该模型保留了天然组织结构，包含所有肾细胞类型和细胞外基质成分，从而提供了一个生理学相关的研究平台。本研究旨在确定先前在动物模型和单细胞培养中观察到的FXR和TGR5激活的抗纤维化效应是否也存在于mPCKS中。

主要技术方法

1. 1.
   mPCKS制备与培养：从8至10周龄雄性C57BL/6小鼠获取肾脏，使用Alabama R&D组织切片机制备精密切割肾切片，并在含特定补充剂的William’s E培养基中于37°C、80% O?和5% CO?条件下振荡培养（90 rpm），培养基每24小时更换一次。
2. 2.
   活力测定：通过刃天青还原为试卤灵的荧光检测及后续ATP测量评估线粒体代谢活性；RNA质量与完整性使用Agilent 2100生物分析仪评估。
3. 3.
   基因表达分析：采用qPCR检测目标基因mRNA水平，并以Gapdh为内参；使用RT-PCR验证胆汁酸受体表达。
4. 4.
   蛋白质免疫印迹：提取组织蛋白后经SDS-PAGE分离、转膜，使用特异性一抗检测目标蛋白，以总蛋白归一化定量。
5. 5.
   免疫组织化学：对石蜡包埋切片进行抗原修复、一抗孵育、HRP标记二抗显色及苏木精复染，用于定位检测胆汁酸受体蛋白。
6. 6.
   TUNEL染色：通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记法检测凋亡细胞，以DAPI复染细胞核，计算TUNEL阳性细胞比例。

研究结果

3.1 mPCKS作为研究肾纤维化中胆汁酸信号传导的模型

通过RT-PCR确认未培养切片中存在胆汁酸受体基因（包括FXR、孕烷X受体（PXR）、维生素D受体（VDR）、组成型雄烷受体（CAR）、TGR5和鞘氨醇-1-磷酸受体2（S1PR2））的表达。qPCR显示，核受体基因表达在培养最初24小时内迅速下降，随后趋于稳定；而膜受体基因在整个培养期间逐渐上升。免疫组化显示，除TGR5随时间染色减弱外，其余受体蛋白变化模式与基因表达相似。总体表明mPCKS可用于研究肾脏胆汁酸信号传导。

3.2 LCA诱导凋亡

暴露于LCA（100 μM）后，mPCKS的ATP水平和刃天青还原能力显著下降，表明组织活力和线粒体功能严重受损；而CDCA处理的切片活力与对照组相当。LCA处理导致前胱天蛋白酶-3蛋白水平在24小时内即显著降低，提示凋亡激活；CDCA处理则在72小时后才出现下降。TUNEL染色进一步证实LCA处理组阳性细胞显著增加，而CDCA组无显著变化。因此，LCA诱导mPCKS凋亡，CDCA不影响切片活力。

3.3 LCA暴露导致RNA降解

对照切片培养24和48小时后RNA质量较高（RIN > 6），电泳可见清晰28S和18S rRNA条带。而LCA暴露切片的RIN值低于6，28S/18S条带弥散或模糊，电泳图谱峰平坦，表明RNA严重降解，进一步证实LCA诱导凋亡和细胞应激，且样本不适合下游基因表达分析。

3.4 CDCA减轻mPCKS纤维化

对照切片在培养过程中自发出现纤维化，表现为Col1a1和Fn1基因上调。CDCA处理显著降低了这两种基因的mRNA水平以及纤连蛋白蛋白表达。机制上，CDCA降低了总SMAD2/3蛋白水平，伴随磷酸化SMAD2/3相应减少，但pSMAD2/3与总SMAD2/3比值不变，说明CDCA降低SMAD2/3丰度而不影响相对磷酸化。此外，CDCA同样能拮抗TGF-β诱导的Col1a1、Fn1 mRNA及纤连蛋白蛋白上调，并降低总SMAD2/3和pSMAD2/3水平。表明CDCA通过降低SMAD2/3蛋白丰度减轻培养诱导和TGF-β诱导的纤维化。

3.5 CDCA的抗纤维化效应不依赖于FXR和TGR5激活

使用FXR拮抗剂DY268和TGR5拮抗剂SBI-115分别阻断两种受体后，CDCA仍能有效抑制TGF-β诱导的纤维化，提示其抗纤维化活性可能独立于FXR或TGR5。值得注意的是，单独使用SBI-115也表现出一定的抗纤维化效果并提高线粒体活性。

讨论与结论

本研究确立了mPCKS作为研究肾纤维化中胆汁酸信号传导的生理学相关离体模型的适用性。mPCKS保留了天然的多细胞相互作用和细胞外基质架构，克服了单细胞培养缺乏细胞间通讯的局限性，且排除了体内实验中代谢、血流等全身性混杂因素，同时符合3R原则（替代、减少、优化），可减少实验动物用量并部分替代体内实验。研究发现，CDCA能完全阻止培养诱导和TGF-β诱导的纤维化，其机制与降低总SMAD2/3蛋白表达有关。尽管CDCA已知是FXR和TGR5的激动剂，但拮抗实验表明其抗纤维化作用不依赖这两条通路，可能与激活PXR等其他受体有关。LCA在100 μM浓度下诱导了mPCKS凋亡，这与既往报道的LCA肾毒性一致，但不同模型间的敏感性差异提示可能存在物种或模型特异性反应。此外，TGR5拮抗剂SBI-115单独使用时也显示出抗纤维化作用，提示TGR5在肾脏病理生理中的作用具有复杂性。研究也指出了局限性：培养过程中胆汁酸受体表达发生变化，部分类似于疾病状态，故mPCKS可能不适合研究生理性胆汁酸信号；切片缺乏循环免疫细胞，无法完全模拟体内炎症过程；且基于小鼠组织的结果需通过人源PCKS研究验证其跨物种可转化性。

研究结论：本研究建立了mPCKS作为研究肾纤维化中肾脏胆汁酸信号传导的生理学相关离体模型。重要的是，此前在单细胞培养和体内模型中报道的CDCA抗纤维化效应在该组织模型中同样存在。mPCKS排除了全身性影响因素，为CDCA对肾脏促纤维化信号的直接调控作用提供了有力证据。