膜穿透性修饰腹水衍生肽TAT-CPAP1通过靶向NOLC1-MDM2/MDM4轴增敏TP53野生型卵巢癌细胞对铂类治疗的反应

《Translational Oncology》：A membrane-penetrating modified ascites-derived peptide, TAT-CPAP1, sensitizes TP53 wild-type ovarian cancer cells to platinum-based therapy through targeting the NOLC1-MDM2/MDM4 axis

　　

肽组学分析鉴定出一种具有化疗增敏作用的腹水肽CPAP1。TAT修饰的CPAP1可增敏TP53野生型卵巢癌对铂类药物的反应。TAT-CPAP1与NOLC1结合并调控MDM2/MDM4轴。NOLC1敲低可增敏TP53野生型卵巢癌细胞对铂类药物的反应。

一、研究背景与目的

卵巢癌（ovarian cancer, OC）是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，其高死亡率主要源于早期诊断困难、广泛的腹膜转移以及高复发率和化疗耐药倾向。上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer, EOC）是最常见的组织学亚型，约占所有卵巢恶性肿瘤的90%。EOC的一线治疗方案是肿瘤细胞减灭术联合铂类化疗或新辅助化疗。然而，超过80%的EOC患者最终会产生化疗耐药，导致5年生存率仅为35%-40%。因此，提高肿瘤对化疗药物的敏感性被视为改善OC临床结局的关键策略。

超过三分之一的OC患者在疾病进展过程中会出现腹水。传统观点认为恶性腹水通常预示着晚期疾病和不良预后。腹水中的成分如癌症相关成纤维细胞和血管内皮生长因子已被证实与化疗耐药有关。然而，新出现的证据也强调了OC相关腹水的矛盾性保护作用。除了促肿瘤成分，腹水中还含有具有潜在抗肿瘤效应的生物活性分子，如白细胞介素-12、干扰素和催产素。临床观察也表明，一部分腹水阳性的OC患者反而表现出增强的化疗敏感性。因此，研究腹水成分以识别化疗增敏因子，为开发新型治疗策略提供了有希望的途径。

肽作为小型生物分子，具有组织穿透性强、免疫原性低、易于合成和结构可修饰等独特的药学优势。基于此，本研究旨在系统性地鉴定恶性腹水中可能与化疗耐药相关或能增强化疗敏感性的OC相关肽，并进一步阐明其分子机制。

二、主要技术方法

研究人员收集了术前来自OC患者的腹水样本，并根据患者随访结果分为化疗敏感组（n=4）和化疗耐药组（n=5），采用液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）进行肽组学分析。通过标准Fmoc固相肽合成法人工合成了差异肽。使用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8, CCK-8）检测细胞活力和半数抑制浓度（half-inhibitory concentration, IC₅₀）。通过流式细胞术进行细胞凋亡检测。利用生物素标记肽进行肽拉下实验（peptide pull-down）结合质谱鉴定靶蛋白。通过免疫荧光（immunofluorescence, IF）观察肽定位和蛋白共定位。使用慢病毒感染构建基因敲低细胞系。通过蛋白质印迹法（western blot）检测蛋白表达水平。对耐药细胞进行RNA测序（RNA-sequencing, RNA-seq）。动物实验使用了雌性BALB/c裸鼠和C57BL/6J小鼠。生物信息学分析利用了UALCAN平台和Kaplan-Meier Plotter数据库。

三、研究结果

CPAP1，一种在化疗应答患者腹水中富集的肽，可增敏OC细胞对顺铂和紫杉醇的反应

通过比较化疗敏感组和耐药组OC患者的腹水肽组，研究人员鉴定出10个上调肽和8个下调肽。人工合成了6个最显著下调的肽（命名为化疗敏感患者腹水衍生肽1-6，CPAP1-CPAP6），结果显示只有CPAP1能够降低A2780细胞对顺铂（cisplatin, DDP）和紫杉醇（paclitaxel, PTX）的IC₅₀，并且这种DDP增敏效应在SKOV3和OVCAR3细胞系中也一致观察到。

TAT肽修饰提高了CPAP1的稳定性和功能，同时不损害其核定位

12个氨基酸的肽CPAP1位于IGHG1和IGHG2的C末端，具有亲脂性。荧光标记显示FITC-CPAP1可进入细胞并聚集于细胞核，半衰期约24小时。为了增强稳定性，研究人员合成了膜穿透性修饰的TAT-CPAP1，其同样能进入细胞质和细胞核并显著聚集于核内，半衰期超过48小时。TAT-CPAP1处理显著抑制了A2780、OVCAR3和A2780DR细胞的增殖。

TAT-CPAP1在体内不会引起明显的肝肾功能损伤

在C57BL/6J小鼠中腹腔注射30 mg/kg TAT-CPAP1连续14天后，与对照组相比，血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、血尿素氮（BUN）和肌酐（CR）水平以及肝肾组织学结构均无显著差异。停药1周后，各项指标仍保持可比，表明TAT-CPAP1无明显肝肾毒性。

TAT-CPAP1在体外特异性抑制TP53野生型OC细胞的增殖

TAT-CPAP1显著抑制所有测试OC细胞的增殖，而对照肽TAT-Scramble在携带TP53突变的OVCAR3、CAOV3、OV90和TOV112D细胞中也显示出相似的抑制作用，但在TP53野生型的A2780和A2780DR细胞中则不然，提示TAT-CPAP1可能通过野生型TP53发挥作用。

TAT-CPAP1通过调控细胞对DNA损伤刺激的应答通路增强OC细胞对铂类的敏感性

TAT-CPAP1与DDP联用比单药更能有效抑制A2780、A2780DR和OVCAR3细胞的生长，并可降低DDP和卡铂（carboplatin, CBP）的IC₅₀值，同时增加DDP或CBP诱导的细胞凋亡率。RNA测序显示差异表达基因富集于细胞对DNA损伤刺激的应答通路，其中多个铂类耐药相关基因（如ERCC5、ATRIP、PSME3）下调，而凋亡相关基因（BCL2L11）上调。

TAT-CPAP1直接结合并与NOLC1蛋白共定位以发挥其铂类增敏作用

通过生物素标记肽的拉下实验结合质谱鉴定，研究人员筛选到四个核定位候选蛋白。蛋白质印迹法验证了NOLC1和CSK21与TAT-CPAP1的特异性结合，而免疫荧光显示只有NOLC1与TAT-CPAP1在细胞内共定位。TAT-CPAP1处理不影响NOLC1蛋白表达水平。生物信息学分析发现，NOLC1蛋白在OC组织中显著上调，且在TP53野生型OC患者中，高NOLC1 mRNA水平与总生存期负相关，尤其是在接受铂类化疗的患者中。

敲低NOLC1在体内外抑制细胞增殖并增加细胞对DDP的敏感性

在A2780细胞中敲低NOLC1后，细胞增殖能力下降，对DDP的敏感性增加。在体内，CBP处理显著抑制了由NOLC1敲低的A2780细胞形成的皮下肿瘤的生长。

TAT-CPAP1和NOLC1均调控MDM2和MDM4的表达以及MDM4的定位

TAT-CPAP1处理或NOLC1敲低均不改变p53蛋白水平，但可下调DDP处理的A2780细胞中MDM2蛋白水平，同时上调MDM4蛋白水平，从而升高MDM4/MDM2比值。免疫荧光分析进一步揭示，TAT-CPAP1处理或NOLC1敲低增强了MDM4的胞质定位，特别是其与线粒体标志物TOMM20的共定位。

四、讨论与结论

本研究报告了从OC腹水肽组学角度首次鉴定出CPAP1——一种在OC腹水中富集并能促进铂类敏感性的肽。CPAP1位于IGHG1和IGHG2的C末端，作为一种阳离子肽，它能直接进入细胞。为了提高其稳定性和胞内递送效率，研究人员设计了细胞穿透肽偶联物TAT-CPAP1，该修饰肽对A2780及其DDP耐药变异株A2780DR均显示出强大的抗肿瘤活性，且未对正常生理功能产生明显不良影响，表明其具有较强的转化潜力。

值得注意的是，TAT-CPAP1以TP53依赖的方式增强OC细胞对DDP的敏感性。进一步的机制研究表明，它主要通过作用于参与p53激活和降解调控网络的NOLC1蛋白来发挥功能。研究发现，TAT-CPAP1处理或NOLC1敲低会降低MDM2并上调MDM4蛋白水平，从而提高MDM4/MDM2比值，这可能是p53稳定性增强的潜在指标。此外，TAT-CPAP1处理或NOLC1敲低增加了MDM4的胞质定位，特别是其与线粒体的共定位，这与线粒体MDM4促进p53 Ser46磷酸化、增强细胞色素C释放和凋亡的报道相符。

总之，本研究揭示了OC恶性腹水中未被充分研究的功能性组分作为一个潜在的治疗靶点，既提供了一种增强铂类化疗敏感性的新策略，也为临床药物开发提供了一个可行的候选分子。