异基因造血细胞移植后慢性移植物抗宿主病发生的前瞻性纵向唾液与血浆细胞因子谱研究

《Transplantation and Cellular Therapy》：Prospective Longitudinal Salivary and Plasma Cytokine Profiling in Chronic Graft-versus-Host Disease After Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation

　　

背景：慢性移植物抗宿主病（chronic graft-versus-host disease, cGVHD）仍是异基因造血细胞移植（allogeneic hematopoietic cell transplantation, allo-HCT）后晚期并发症和健康相关生活质量受损的主要原因。尽管已研究多种循环生物标志物，但多数研究采用横断面设计，血浆样本采集于疾病诊断或免疫抑制治疗开始之后。评估cGVHD发生过程中配对唾液和血浆炎症生物标志物的前瞻性纵向研究仍然罕见。

目的：前瞻性评估与allo-HCT后cGVHD发生相关的选定唾液和血浆炎症生物标志物的纵向变化。

方法：接受首次allo-HCT的患者从预处理前（T₀）前瞻性随访至移植后第一年。血液和非刺激唾液样本在两个时间点采集：预处理前（T₀）和cGVHD诊断时（T₁），且在任何免疫抑制治疗开始前。未发生cGVHD的患者在+365天（±15天）采样。炎症细胞因子通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）定量，并在各组内以及有无cGVHD患者之间进行纵向分析。

结果：共纳入41例患者，其中13例发生cGVHD，28例未发生cGVHD。在无cGVHD患者中，经多重比较校正后，血浆白细胞介素（interleukin, IL）-1β和唾液IL-8从T₀至T₁显著下降；唾液IL-1β在假发现率（false discovery rate, FDR）校正后也下降，但Bonferroni校正后未达显著。cGVHD组无纵向生物标志物变化达到统计学显著性。在T₁，cGVHD组血浆和唾液中IL-6浓度在名义分析中较高，但这些差异经多重比较校正后未保持统计学显著性。

结论：这项探索性研究识别了allo-HCT后选定炎症生物标志物的纵向变化，尤其是在未发生cGVHD的患者中。T₁观察到的组间差异仅限于名义分析，需要在更大规模、时间匹配的前瞻性队列中确认。这些发现支持继续研究唾液细胞因子谱作为allo-HCT后纵向炎症监测的可行、非侵入性方法。

研究背景与目的：异基因造血细胞移植（allogeneic hematopoietic cell transplantation, allo-HCT）临床应用日益增加，但慢性移植物抗宿主病（chronic graft-versus-host disease, cGVHD）仍是移植后晚期非复发并发症和死亡的重要原因，影响约30%–50%长期生存者，并显著损害生活质量。cGVHD由持续性免疫失调所致，涉及供者来源T细胞和B细胞活化、异常细胞因子信号及进行性组织纤维化。尽管多种循环细胞因子等炎症介质被作为候选生物标志物研究，但结果异质，且尚未进入常规临床实践。唾液因可非侵入、重复、低成本采集，并可反映局部和全身炎症反应，而口腔又是cGVHD常受累和较早受累部位，因此具有纵向监测潜力。然而，既往唾液生物标志物研究多为横断面、单时间点、已确诊口腔cGVHD且多在免疫抑制治疗后采样，且少同时分析唾液和血浆，难以判断唾液细胞因子是否反映全身炎症变化。基于此，研究人员开展前瞻性纵向研究，评估从移植前基线至cGVHD诊断的配对唾液和血浆细胞因子谱，且样本采集在免疫抑制治疗前，假设纵向炎症生物标志物模式随后续cGVHD状态不同。

研究设计与结论意义：该研究为单中心前瞻性纵向观察队列，最终纳入41例首次allo-HCT患者，其中13例发生cGVHD，28例未发生cGVHD。研究人员报告，无cGVHD患者中部分炎症生物标志物从T₀至T₁下降，且血浆IL-1β和唾液IL-8的下降经FDR和Bonferroni校正后仍显著；cGVHD组未观察到纵向显著变化；T₁时cGVHD组血浆和唾液IL-6仅在名义分析中较高，校正后不显著。研究结论强调，这些组间差异需在更大规模、时间匹配的前瞻性队列中确认，并支持继续研究唾液细胞因子谱作为allo-HCT后纵向炎症监测的可行、非侵入性方法。

主要关键技术方法：研究来源为巴西圣保罗大学Ribeir?o Preto医学院的单中心前瞻性纵向观察队列，伦理批准号56741322.4.0000.5440。研究对象为2019年1月至2022年12月接受首次allo-HCT、年龄≥12岁的连续患者，采用便利抽样，未进行正式先验样本量或把握度计算。采集配对非刺激唾液和外周血，时间点为T₀预处理前24小时、T₁cGVHD诊断时且免疫抑制治疗前，或无cGVHD者在+365天（±15天）。以ELISA定量IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及乳铁蛋白，并按总蛋白归一化。统计采用Wilcoxon配对符号秩检验、Mann–Whitney U检验、卡方检验、Student t检验及Spearman秩相关，并使用FDR和Bonferroni校正。

研究结果：
研究人群：初筛73例，按预设标准排除32例，最终41例纳入分析，其中13例发生cGVHD，28例未发生cGVHD。cGVHD组有3例在生物样本采集后死亡，原因包括疾病复发、cGVHD相关并发症（2例）及无法确定的原因（1例）。基线人口学和移植特征无传统统计学显著差异，但受体性别、供者类型和预处理强度存在数值不平衡；因cGVHD事件少，未拟合多变量模型，这些因素被视为潜在残余混杂。菌斑指数（Plaque Index）在T₀和T₁均未显示组间显著差异。

慢性GVHD临床特征：13例cGVHD患者中，新发（de novo）6例、进展型（progressive）3例、静止型（quiescent）3例、再激活型（reactivated）1例。口腔受累8例（61.5%），其中孤立口腔受累5例，合并其他器官受累3例；其他器官受累5例。总体严重度为轻度8例、中度2例、重度3例。移植至cGVHD诊断中位时间为258天（范围47–764天）。

纵向细胞因子变化：在无cGVHD患者中，血浆IL-1β从T₀至T₁下降，名义P<.001，FDR校正P=.010，Bonferroni校正P=.010；唾液IL-8下降，名义P=.005，FDR校正P=.023，Bonferroni校正P=.046；唾液IL-1β下降，名义P=.010，FDR校正P=.035，但Bonferroni校正P=.105未保持显著。cGVHD组无任何纵向生物标志物变化达到统计学显著性。

cGVHD组与非cGVHD组细胞因子表达比较：在T₁，cGVHD组血浆IL-6较高，名义P=.036，但FDR校正P=.178、Bonferroni校正P=.356；唾液IL-6较高，名义P=.009，FDR校正P=.094、Bonferroni校正P=.094；唾液IL-8呈数值差异，名义P=.058。T₀时唾液TNF-α名义差异P=.028，多重校正后不显著。由于T₁在两组对应移植后时间不同，这些比较需结合采样时间不等同解释。

按口腔受累和cGVHD严重度进行的探索性分析：在cGVHD患者中，有口腔受累与无口腔受累者相比，唾液IL-8名义P=.045、IL-1β名义P=.045、乳铁蛋白名义P=.019，但FDR校正后均P=.075，未保持显著。NIH全局cGVHD严重度序数分析中，血浆乳铁蛋白与严重度呈负相关（ρ=-.727；名义P=.0049；FDR校正P=.049；Bonferroni校正P=.049），但严重度分层例数少（轻度8例、中度2例、重度3例），需独立验证。

讨论总结：该研究从预处理前到移植后随访，配对评估血浆和唾液炎症生物标志物。无cGVHD患者中部分标志物下降在校正后显著，而cGVHD组无纵向显著变化；T₁时IL-6名义升高未在校正后保持显著；cGVHD诊断时样本采集于免疫抑制治疗前，减少了治疗相关混杂。既往cGVHD生物标志物研究多采用横断面设计并在诊断或治疗开始后采样，唾液研究仍少。讨论中总结，IL-1β参与抗原提呈细胞（antigen-presenting cells, APC）活化及辅助性T细胞17（T helper 17, Th17）分化，与cGVHD病理相关；巨噬细胞和髓系细胞释放IL-1β、TNF-α和IL-6，促进cGVHD组织纤维化。IL-6主要通过信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）信号通路发挥作用，且与cGVHD相关；唾液IL-6曾与口腔cGVHD和口腔黏膜病变相关。IL-8为趋化因子，参与白细胞募集和向靶组织迁移，在急性GVHD、眼GVHD等移植后炎症并发症中可见升高。唾液优势在于可重复、非侵入采样，适合移植后密切监测。探索性口腔受累分析未在校正后保持显著。基线唾液TNF-α名义升高不应解释为预测或保护效应。局限性包括：T₁在两组对应移植后时间不同，cGVHD患者中位诊断时间为258天，而无cGVHD患者为+365天（±15天），差异可能部分反映移植后免疫重建时间差异；cGVHD例数少、单中心、基础疾病异质、无外部验证、仅限预定义标志物组合、基线不平衡导致残余混杂；菌斑指数无组间差异，但样本量有限，不能排除口腔卫生或局部炎症的残余混杂。活动性感染和移植前口腔条件已通过入组标准和机构口腔护理流程处理。

研究结论（翻译）：这项探索性前瞻性研究识别了allo-HCT后选定炎症生物标志物的纵向变化，其中未发生cGVHD患者中血浆IL-1β和唾液IL-8的下降在FDR和Bonferroni校正后均保持稳健。T₁时IL-6的名义组间差异经多重性校正后未保持统计学显著性。总之，这些发现支持继续研究唾液作为纵向炎症生物标志物的非侵入性来源，同时强调需要更大规模、多中心、采样时间一致的队列，并在临床效用确立前进行独立验证。