咔唑–丙烯酰胺–吡啶鎓-N-苯基乙酰胺杂合物的设计、合成及其作为乙酰胆碱酯酶/丁酰胆碱酯酶双抑制剂与对SH-SY5Y和HEK293细胞毒性评价

《RSC Medicinal Chemistry》：Design and synthesis of carbazole–acrylamide–pyridinium hybrids as dual acetylcholinesterase/butyrylcholinesterase inhibitors and evaluation of their cytotoxic profile on SH-SY5Y and HEK293 cell linesOpen Access

　　

设计并合成了一系列十七个咔唑–丙烯酰胺–吡啶鎓-N-苯基乙酰胺杂合物（12a–q），作为阿尔茨海默病（AD）潜在治疗的乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）双重抑制剂。以他克林（tacrine）和加兰他敏（galantamine）为参考标准，评价其对两种酶的抑制活性。他克林对AChE和BChE的IC₅₀值分别为58.34 nM和160.50 nM，而加兰他敏分别为124.72 nM和216.23 nM。合成衍生物对AChE的IC₅₀值为6.41–74.93 nM，对BChE为38.05–191.96 nM。所有化合物均比加兰他敏更有效，且大多数化合物也优于他克林。化合物12i是最有效的AChE抑制剂（IC₅₀ = 6.41 nM），其效力分别比他克林和加兰他敏高9.1倍和19.5倍。化合物12g是最强的BChE抑制剂（IC₅₀ = 38.05 nM），其活性分别比他克林和加兰他敏高4.2倍和5.7倍。动力学分析显示，所有最有效化合物均作为竞争性抑制剂。细胞毒性评价显示，化合物12i和12g对HEK293细胞的毒性低于索拉非尼（sorafenib），并对SH-SY5Y细胞具有有利选择性。这些结果确立了咔唑–丙烯酰胺–吡啶鎓支架作为开发更安全阿尔茨海默病胆碱酯酶抑制剂的有前景先导。

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是最常见的神经退行性疾病和痴呆主要原因，占全部痴呆病例的60–80%。尽管AD病因多因素，包括淀粉样β积累、tau病理、氧化应激、神经炎症和多个神经递质系统紊乱，但胆碱能假说仍是唯一具有成熟药理治疗基础的神经化学依据。胆碱能神经元退化和乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）缺乏是导致认知下降和功能损害的特征。当前标准治疗药物多奈哌齐、利凡斯的明和加兰他敏通过选择性抑制乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）提高突触ACh水平，但近期药理研究表明，尤其在AD晚期，丁酰胆碱酯酶（butyrylcholinesterase, BChE）显著参与ACh降解。因此，靶向AChE和BChE的双重抑制策略被认为是更全面、可能更优的治疗方法。分子杂交是药物化学中设计新生物活性化合物的重要策略，研究人员从文献中识别有效药效团并用合适连接子连接。咔唑是重要药效团，为含三环氮杂环，其衍生物可抑制AChE和BChE；丙烯酰胺可作为连接子；吡啶鎓-N-苯基乙酰胺片段存在于强效胆碱酯酶（cholinesterase, ChE）抑制剂中，且吡啶鎓可作为多奈哌齐可质子化氮的生物电子等排体，模拟与酶催化阴离子位点的离子相互作用。

研究人员据此将咔唑和吡啶鎓-N-苯基乙酰胺作为两个药效团，以丙烯酰胺连接，设计咔唑–丙烯酰胺–吡啶鎓-N-苯基乙酰胺支架作为新一类ChE抑制剂，并合成十七个衍生物（12a–q），进行体外和计算机评价。此外，鉴于胆碱酯酶抑制剂在神经退行性疾病作用外，还在包括神经母细胞瘤的多种癌细胞系中显示抗增殖和促凋亡效应，研究人员也评价这些杂合物的潜在抗神经母细胞瘤活性。

关键技术方法概括：研究人员通过N-烷基化、Vilsmeier甲酰化、Knoevenagel缩合、TBTU/Et₃N酰胺化和SN2季铵化等化学反应合成12a–q。采用Ellman比色法评价对AChE（E.C. 3.1.1.7，电鳗来源）和BChE（E.C. 3.1.1.8，马血清来源）的抑制活性，以他克林和加兰他敏为参考。分子对接采用Schr?dinger软件、Glide XP和诱导契合对接（induced fit docking, IFD），并用MM-GBSA计算结合自由能；分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟在Desmond中进行500 ns，应用OPLS4力场。细胞毒性采用MTT法，在SH-SY5Y（ATCC? CRL-2266?）和HEK293（ATCC? CRL-1573?）细胞系中评价。

Chemistry（化学）：通过N-烷基化咔唑（1）与苄溴（2a）或碘乙烷（2b）在KOH存在下得到3a或3b；Vilsmeier甲酰化在C3位得到醛5a–b；与丙二酸经β-丙氨酸/吡啶催化Knoevenagel缩合得到丙烯酸6a–b；再与pyridin-3-ylmethanamine（7）在TBTU/NEt₃下得到8a–b；苯胺衍生物9a–i与氯乙酰氯（10）反应得到2-氯-N-取代乙酰胺11a–i；最终8a–b与11a–i在乙腈回流经SN2烷基化得到12a–q。该路线成功获得目标杂合物，结构由光谱和元素分析表征。

Evaluation of target compounds 12a–q against AChE and BChE（目标化合物12a–q对AChE和BChE的评价）：通过Ellman法，他克林AChE/BChE的IC₅₀为58.34/160.50 nM，加兰他敏为124.72/216.23 nM。12a–q对AChE的IC₅₀为6.41–74.93 nM，对BChE为38.05–191.96 nM；所有化合物优于加兰他敏，多数优于他克林。12i为最强AChE抑制剂（IC₅₀ = 6.41 nM），12g为最强BChE抑制剂（IC₅₀ = 38.05 nM）。构效关系显示，苄基系列12a–i和乙基系列12j–q中，吸电子基（卤素、硝基）增强AChE抑制，对位更有利；4-NO₂ 12i、4-F 12f、4-Cl 12g的AChE抑制最强，而给电子基降低活性。乙基系列中4-Cl 12o、4-F 12n、2,4-di-Cl 12p、4-NO₂ 12q均优于他克林。BChE抑制中，苄基系列的4-位吸电子基增强活性，12g、12f、12i较强；2-取代通常较弱。乙基系列中4-NO₂ 12q、4-F 12n、4-Cl 12o、2,4-di-Cl 12p较强。除4-硝基衍生物外，苄基一般比乙基更强，提示芳香堆叠作用。

Kinetic studies of the most potent compounds against AChE and BChE（最有效化合物对AChE和BChE的动力学研究）：通过Lineweaver-Burk图和二次图，在AChE选择12i、12o、12f，在BChE选择12g、12f、12q。增加浓度不显著影响Vmax，表观Km增加，表明竞争性抑制。AChE的K_i为12i 5.03±0.37、12o 5.61±0.45、12f 6.93±0.60，他克林50.35±7.10，加兰他敏97.28±9.34；BChE的K_i为12g 31.48±4.83、12f 35.70±6.20、12q 41.22±5.01，他克林126.08±7.41，加兰他敏173.56±9.98。所选化合物对两酶均为竞争性抑制剂。

Molecular docking studies（分子对接研究）：通过IFD和MM-GBSA，12i–AChE的IFD得分为?16.755 kcal mol^?1，ΔG_bind为?100.88 kcal mol^?1；他克林–AChE为?10.530和?55.36。12g–BChE的IFD得分为?14.808，ΔG_bind为?99.88；他克林–BChE为?7.500和?46.87。12i与AChE中，吡啶鎓氮与Trp-286形成π–cation和π–π堆积，α,β-不饱和羰基氧与Arg-296和Phe-295形成氢键，Tyr-72的酰胺氮形成氢键，咔唑环与Phe-338、Tyr-337、His-447、Tyr-124形成多π–π堆积。12g与BChE中，吡啶鎓与Glu-197形成盐桥，与Trp-82形成两个π–cation和两个π–π，酰胺氮与Asp-70、His-438形成氢键，氯苯环与Trp-231、Phe-329形成π–π；咔唑不参与BChE相互作用。结论是两化合物强于他克林，关键相互作用稳定复合物。

Molecular dynamics simulations（分子动力学模拟）：通过500 ns MD，12i–AChE中羰基氧与Phe-295氢键维持99%，酰胺氮与Tyr-341维持71%；吡啶鎓氮与Trp-286 π–cation和π–π均维持99%，与Tyr-72 π–cation维持35%；咔唑与Trp-86、Tyr-337、Tyr-124、Tyr-341有π–π。平均C_α RMSD为1.20 ?，配体相对蛋白RMSD为1.5 ?，配体相对自身RMSD为0.75 ?；C_α RMSF约0.6 ?。12g–BChE中吡啶鎓氮与Trp-82 π–cation和π–π均99%，Glu-197盐桥99%；酰胺氮与Ala-328水桥氢键30%，另一酰胺氮与Ser-198直接氢键；氯苯环与Trp-231 π–π 44%。平均C_α RMSD为1.2 ?，配体相对蛋白RMSD在0–300 ns约1.2 ?后到2.4 ?，配体相对自身RMSD从0.8到2.0 ?；RMSF约1.0 ?。结论是MD验证对接结果，两复合物动态稳定；12g在300 ns后配体RMSD轻度位移但蛋白骨架稳定。

Cytotoxicity（细胞毒性）：通过MTT法在SH-SY5Y和HEK293中评价。IC₅₀对SH-SY5Y为7.11–21.35 μM，对HEK293为12.34–50.21 μM。12i对SH-SY5Y的IC₅₀为7.11 μM，选择性指数（selectivity index, SI）为7.0；12g为8.60 μM，SI为5.8；均优于索拉非尼SI 4.2。12e和12f的IC₅₀为21.35和10.88 μM。12a、12b、12c、12e、12k、12l较弱。构效关系显示，吸电子基（–NO₂、–Cl、–F）增强活性，对位更有利；给电子基（–Me、–OMe）降低活性；R1从苄基到乙基略降低活性。苄基和对位吸电子衍生物尤其12i和12g兼具抗神经母细胞瘤活性和低正常细胞毒性，治疗窗有利。

讨论部分总结：该研究成功开发新一类咔唑–丙烯酰胺–吡啶鎓-N-苯基乙酰胺杂合物，所有衍生物对AChE和BChE优于加兰他敏，多数优于他克林，验证分子杂交策略。12i和12g为最有前景候选物，竞争性抑制且强于参考药。实验与计算数据强相关，证实稳定有利的酶–配体相互作用。细胞毒性评价显示多数衍生物对癌细胞中到强活性，对正常细胞低毒，治疗窗有利。该支架可作为进一步优化和开发更安全抗AD候选药的有价值框架，但仍缺乏体内和血脑屏障通透性研究。

研究结论翻译：总之，本研究成功开发了一类新的咔唑–丙烯酰胺–吡啶鎓-N-苯基乙酰胺杂合物（12a–q）作为强效ChE抑制剂，并以他克林和加兰他敏为参考标准进行评价。值得注意的是，所有合成衍生物对AChE和BChE均优于加兰他敏，大多数也比他克林更强，进一步验证了分子杂交策略的成功。化合物12i（AChE）和12g（BChE）被鉴定为最有前景的候选物，二者均通过竞争性抑制发挥作用，且效力显著高于两种参考药物。实验与计算数据之间的强相关性证实了稳定且有利的酶–配体相互作用。重要的是，对SH-SY5Y神经母细胞瘤和HEK293正常细胞的细胞毒性评价显示，大多数衍生物对癌细胞具有中到强活性，同时对正常细胞保持低毒性，表明具有有利的治疗窗。总体而言，这些发现提出咔唑–丙烯酰胺–吡啶鎓支架作为进一步优化和开发更安全抗阿尔茨海默病候选药物的有价值框架，但仍缺乏体内和BBB通透性研究。