基于电化学DNA发夹传感器的嵌入剂与沟槽结合剂区分策略及其生物物理设计原则

《Sensors and Diagnostics》：Electrochemical DNA hairpin sensors for differentiating small molecule intercalation from minor groove bindingOpen Access

　　

小分子双链DNA嵌入剂在治疗应用中具有显著潜力。然而，筛选并确认候选药物的嵌入行为仍然费力且成本高昂。为解决这一问题，研究人员研究了影响电化学DNA发夹传感器性能的序列与生物物理参数，以简化结构嵌入剂的识别流程。该类传感器利用寡核苷酸序列，在嵌入剂结合时形成发夹结构。寡核苷酸的3′末端修饰有烷基硫醇连接基，用于金电极表面单层自组装，而5′末端携带亚甲蓝（methylene blue）氧化还原报告基团。发夹结构的形成增强了亚甲蓝与金电极之间的电子转移效率，可通过伏安法（voltammetry）进行检测。研究人员测试了七种茎长与序列各异的发夹结构。最优寡核苷酸HP4具有四碱基对茎区，可在宽检测范围内响应五种DNA嵌入剂，其半数有效浓度（EC50）与已报道的上述相互作用亲和常数（KD）高度一致。研究人员进一步证明，HP4可通过孵育后信号增益的显著差异，将嵌入剂结合与一系列小沟结合剂区分开来。综上，该策略建立了一个识别嵌入性化合物的平台，有望支持DNA靶向治疗药物的开发。

一、研究背景与问题

DNA嵌入剂是一类能够插入双螺旋核酸碱基对之间的小分子，其结合会改变DNA的二级结构，引起双链伸长并通常增强热稳定性，进而影响DNA与蛋白质的相互作用。这类结构扰动既可参与病理过程，也为治疗干预提供了契机，例如FDA批准的蒽环类嵌入剂多柔比星、表柔比星和戊柔比星已用于实体瘤与血液肿瘤治疗。然而，确认某一化合物是否具有嵌入结合模式通常成本高昂、耗时费力，且需要与沟槽结合、静电相互作用等其他结合模式进行区分。

目前确认嵌入结合的基准方法包括X射线晶体学、核磁共振波谱等直接结构确认技术，以及光镊、力显微镜等单分子方法，但这些技术操作难度大、耗时长，不适合化合物库的快速筛选。间接方法如粘度测量、热变性研究和光谱学方法虽更适于药物开发中的快速筛选，但同样可能响应其他结合模式，仍需直接方法进行后续确认。因此，开发一种能够快速、便捷且可靠地识别DNA嵌入剂的筛选平台具有重要的应用价值。

二、研究内容与结论

研究人员提出了一种基于核酸电化学传感器的新型替代技术，旨在比传统直接方法更快速地识别嵌入剂，并适用于药物筛选。研究围绕两个核心问题展开：一是构成选择性嵌入剂检测NBE所需寡核苷酸发夹的最小设计要求是什么；二是基于该最小化设计，影响NBE最大信号增益的因素有哪些。

为回答这些问题，研究人员合成了一系列设计DNA发夹，比较了其DSC和¹H NMR熔解行为与电极结合状态下的电化学行为，最终确定了一个能够在宽嵌入剂浓度范围内最大化传感器信号输出的发夹设计——HP4。该发夹对嵌入剂相对于小沟结合剂表现出近三倍的最大信号增益差异，表明该平台可作为药物发现与开发研究中评估嵌入剂候选化合物的有效工具。

三、关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术手段：差示扫描量热法用于测定不同茎长发夹的熔解温度；¹H NMR波谱用于检测亚氨基质子随温度变化的溶剂可及性，以更灵敏地识别低群体折叠态；方波伏安法结合频率图用于表征传感器在不同温度、靶标浓度下的电子转移行为；NUPACK二级结构预测用于辅助序列设计。所有传感器均基于金电极混合自组装单层构建，寡核苷酸经3′烷基硫醇修饰固定于电极表面，5′端连接亚甲蓝氧化还原报告基团。

四、研究结果

1. 1.
   亚甲蓝修饰对发夹稳定性的影响：DSC测量表明，游离亚甲蓝可使HP10熔解温度升高约5 °C，而共价连接的亚甲蓝使熔解温度降低约10 °C，说明亚甲蓝连接基对发夹茎区具有去稳定作用，这一效应在NBE受体设计中需加以考虑。
2. 2.
   最小稳定茎长的确定：通过逐步缩短茎区并进行DSC测量，确定HP6为在实验电解质条件下可观察到明确熔解转变的最短发夹，而HP5无可见转变。NMR检测到HP5存在部分茎区形成，但对HP4未观察到亚氨基峰，表明其动态性过高。据此研究人员选择HP4作为理想传感器寡核苷酸。
3. 3.
   频率图表征HP4传感行为：在无靶标条件下，HP4在5 °C呈现高频折叠态峰，随温度升高逐渐转变为低频展开态。加入SYBR Gold后，HP4呈现单一高频态，表明嵌入剂使平衡向茎环结构偏移。在20 °C下，HP4主要以展开态存在，而较长茎发夹主要以折叠态存在。
4. 4.
   茎长与沉积浓度对传感器性能的影响：HP4传感器在饱和时增益约250%，EC₅₀为200 nM，与SYBR Gold的报道亲和常数（K_D = 273 ± 26 nM）高度一致。茎长增加使增益恶化，HP7甚至呈现负增益；茎缩短至HP1虽增益增至约400%，但EC₅₀显著变差。200 nM沉积浓度可获得最大增益和最低EC₅₀。
5. 5.
   环长与碱基替换的影响：将HP4的18 dT环缩短为5 dT使增益降低三倍但EC₅₀改善至约100 nM。将HP1的G–C碱基对替换为A–T碱基对使增益降低两倍、EC₅₀增加两倍，表明发夹稳定性与最大信号增益之间存在重要关联。
6. 6.
   嵌入剂与小沟结合剂的区分：HP4传感器对溴化乙锭、多柔比星、米托蒽醌和玫瑰树碱四种嵌入剂的最大增益分别为167 ± 14%、186 ± 8%、237 ± 22%和150 ± 11%，而对Hoechst 33258、普鲁卡因、furamidine和丙脒腙四种小沟结合剂的增益均低于55%。在10 μM标准浓度下，所有嵌入剂增益均超过100%，而小沟结合剂远低于该阈值。

五、讨论与结论

研究人员指出，虽然本研究中构建的传感器并非适配体，但研究结果对适配体电化学传感平台具有启示意义，因为双链茎区是适配体的常见结构元件，嵌入剂可能通过稳定折叠状态导致非特异性响应。茎结构是传感器性能的关键决定因素，常通过截短或序列修饰进行优化，因此对核酸传感器中序列、结构与生物物理行为关系的深入理解可提供广泛适用的设计原则。

研究结论指出，HP4修饰的NBE平台可用于识别DNA嵌入剂，其四碱基对茎区结构经DSC和NMR指导分析选定，频率图表明HP4在20 °C下主要以展开态存在，嵌入剂结合通过稳定茎环结构产生显著信号增益，可有效区分嵌入剂与小沟结合剂。嵌入剂在微摩尔浓度下产生的最大信号增益至少是小沟结合剂的三倍。该平台有望用于药物发现中DNA嵌入性治疗候选化合物的早期识别，并计划进一步发展为高通量筛选系统。