基于QbD的阿米替林–辣椒素甘油体纳米凝胶开发与优化：经皮给药改善糖尿病神经病理性疼痛

《RSC Pharmaceutics》：Development and QbD enabled optimization of amitriptyline–capsaicin loaded glycerosomal nanogel formulation to ameliorate neuropathic pain in diabetes mellitus via the topical routeOpen Access

　　

神经病理性疼痛是慢性糖尿病的常见后果，也是临床及社会经济困难的重要促成因素。盐酸阿米替林（amitriptyline hydrochloride, AMT）和辣椒素（capsaicin, CAP）已被研究用于缓解神经病理性疼痛。为降低与药物相关的全身不良事件风险，研究人员配制了含阿米替林和辣椒素的甘油体纳米凝胶，以实现局部组织浓度升高。采用三因素三水平中枢复合设计（central composite design, CCD）进行制剂优化，其中磷脂浓度、胆固醇和甘油被选为自变量，囊泡大小、多分散指数（polydispersity index, PDI）和包封效率被选为因变量响应。优化制剂的囊泡大小为165.3 ± 1.5 nm，PDI为0.36 ± 0.01，AMT和CAP的包封效率分别为（87.12 ± 2.20%）和（76.45 ± 4.68%）。体外释放结果显示持续释药模式，AMT和CAP的释放分别为78.10 ± 1.19%和75.71 ± 1.03%。甘油体纳米凝胶的流变图显示动态黏度为13 858 mPa s。根据离体渗透研究，约80%的药物在24 h内渗透。还进行了离体生物黏附以分析凝胶的生物黏附强度指标。采用共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）评估AMT–CAP甘油体（AMT–CAP GMs）的渗透程度。结果表明皮肤渗透和滞留改善，突出其作为局部载体的适用性。研究人员所在实验室正在进行体内研究，以考察所开发纳米凝胶制剂在神经病理性疼痛管理中的治疗功效。

糖尿病（Diabetes Mellitus, DM）是一种内分泌代谢性疾病，以胰岛素抵抗或胰腺胰岛素分泌部分/完全缺陷导致持续性血糖升高为特征。糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy, DPN）是常见的慢性后果，影响高达50%的长期糖尿病患者；估计16%–26%的糖尿病患者存在糖尿病周围神经病理性疼痛。全球患病率上升，预计2040年近6.4亿人受累。DPN是一种常无症状且复杂的微血管病症，表现为自主神经和周围神经纤维逐渐变性，患者存在周围神经功能和结构改变，包括神经传导速度降低、轴突变性和旁结节脱髓鞘。多数患者出现中度至重度持续性下肢不适，显著影响睡眠、情绪、功能和生活质量，并且是足部截肢的主要原因，带来显著经济负担。虽然初始治疗聚焦于改善和稳定血糖控制，但通常仍需辅助药物。痛性糖尿病周围神经病变（painful diabetic peripheral neuropathy, pDPN）治疗仍是巨大挑战，一线单药治疗中三分之一患者仅获得轻度（30–50%）疼痛缓解，可能与剂量限制性不良事件有关。因此需要新型协同治疗策略以克服单药治疗限制。AMT是一种三环类抗抑郁药（tricyclic antidepressant, TCA），具有显著镇痛特性，获美国FDA批准用于神经病理性疼痛管理，可降低去甲肾上腺素和5-羟色胺再摄取并阻断多种外周受体，但抗胆碱能作用、镇静等不良反应限制其口服高剂量使用。CAP是辣椒中强效生物碱，为瞬时受体电位香草酸亚型1（transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1）高度特异性激动剂，主要表达于细小疼痛传导C纤维；CAP亲脂、不溶于水，抵抗血液吸收和全身摄取，经皮扩散差，且口服吸收低。开发含CAP局部镇痛剂的意义在于CAP可基本保持于靶部位皮肤，而经皮吸收的CAP会被快速清除。皮肤神经末梢具有TRPV1、神经生长因子、阿片/内啡肽及内源性激动剂等受体，中枢神经系统和皮肤均起源于神经外胚层，因此局部给药可影响传入输入和神经信号传递。甘油体是新型双层囊泡，由磷脂和水组成并含大量无毒甘油（20–40%），可递送亲脂和亲水药物，具有类似膜结构和高生物相容性，适合局部递送；其柔性组成和甘油增强的变形性有利于渗透和穿透。此前尚无局部AMT和CAP甘油体纳米凝胶（联合或单独）研究报道。因此，研究人员拟开发含AMT和CAP的局部甘油体纳米凝胶，用于经皮途径管理DPN，提高局部组织浓度并减少全身暴露，可能优于口服药物并可作为附加干预。

研究人员采用质量源于设计（Quality by Design, QbD）理念，结合实验设计、统计建模和实验验证，开发并优化AMT–CAP甘油体纳米凝胶，并对其体外、离体和皮肤渗透行为进行评价。研究得出，优化配方具有较小囊泡、可接受PDI、较高包封效率、持续释放和改善的皮肤渗透与滞留，适合作为局部载体；所提出的AMT–CAP甘油体纳米凝胶是糖尿病周围神经病理性疼痛局部治疗的可行制剂平台，并为后续临床前和临床研究提供基础。

关键技术方法概括（不超过250字）：采用改进薄膜水合法制备AMT–CAP甘油体；以三因素三水平CCD优化，自变量为磷脂浓度、胆固醇和甘油，响应为囊泡大小、PDI及AMT/CAP包封效率；以QbD、质量目标产品概况、关键质量属性及Ishikawa鱼骨图进行风险评估，并用Design-Expert和Minitab 17分析。用Malvern Zetasizer测粒径、PDI和zeta电位；离心-UV法测包封效率；TEM和光学显微镜观察形态；DSC、FTIR、XRD考察相容性；Franz扩散池进行体外释放和离体皮肤渗透；流变仪和质构仪表征凝胶；离体生物黏附使用C57BL/6小鼠皮肤，小鼠来源为Central Animal House, Jamia Hamdard, New Delhi, India，伦理批准IAEC Protocol No. 2024，CPCSEA Registration No. 173/GO/Re/S/2000/CPCSEA；CLSM观察渗透；进行6个月稳定性考察。

研究结果如下。3.1 通过UV分析进行AMT和CAP相容性分析：UV吸收光谱显示AMT和CAP的λ_max分别为240 nm和281 nm，在270 nm存在明确等吸收点，1∶1和1∶5比例重复扫描稳定，未见λ_max显著位移或吸光度强度变化，表明二者无化学相互作用并适合进一步制剂开发。3.2 通过HPLC进行药物相容性分析：AMT和CAP单独及混合物色谱峰分离良好，混合物中AMT保留时间2.816 min、CAP为13.440 min，无额外、合并或移位峰，表明二者化学相容且可同时测定。3.3 热行为（DSC）：AMT和CAP分别在200.03 °C和63.58 °C出现尖锐峰，二元混合物出现274.98 °C和66.01 °C峰，AMT原特征峰消失并出现新的高能吸热峰，表明低熔点CAP在加热时作为液体溶剂溶解AMT，并发生热驱动多晶型转变和共晶介导的固相重构，二者在固态下物理混溶。3.4 QbD实施：建立QTPP和CQAs，以Ishikawa鱼骨图评估变量对CQAs的潜在影响，并将流变行为和皮肤渗透作为与局部应用直接相关的性能相关CQAs。3.5 基于CCD响应面法优化甘油体：20个配方包括6个中心点，囊泡大小80.23–316.07 nm，PDI 0.05–0.49，AMT包封效率60.77%–98.43%，CAP为52.39%–93.17%；二次模型显著，模型F值高，R²分别为0.9999、0.9999、0.9968和0.9944，失拟不显著，模型预测能力良好。3.5.1 响应分析。3.5.1.1 自变量对囊泡大小的影响：磷脂浓度呈显著正线性效应，高磷脂产生较大囊泡；胆固醇先使囊泡略增，进一步增加可压缩膜并降低囊泡大小；高甘油增加囊泡大小，低甘油降低囊泡大小。3.5.1.2 自变量对PDI的影响：磷脂、胆固醇和甘油增加均使PDI升高；甘油呈非线性效应，低浓度提高均一性，高浓度破坏双层堆积并增加变异性。3.5.1.3 自变量对包封效率的影响：磷脂增加可提供更多双层基质，提高包封效率；低胆固醇稳定双层、减少泄漏并改善包封，高胆固醇与药物竞争双层空间而降低包封；甘油先通过改善柔性和防止聚集提高包封，高浓度则破坏双层 packing、增加流动性和通透性并促进泄漏，CAP包封效率呈类似趋势。3.6 设计验证：优化配方为50 mg磷脂、5 mg胆固醇和20%甘油；预测囊泡大小165.80 nm，AMT包封效率86.47%，CAP为71.05%，PDI 0.27；实测分别为165.3 nm、86.12%、70.65%和0.37，预测与实测吻合。3.7 优化AMT–CAP GMs表征。3.7.1 囊泡大小、PDI和包封效率：优化配方平均囊泡大小165.3 ± 1.5 nm，PDI 0.36 ± 0.01，包封效率87.12 ± 2.20%，表明单分散囊泡具有足够载药能力。3.7.2 Zeta电位：优化甘油体zeta电位为?37.21 mV，强负表面电荷有利于静电稳定、减少聚集和融合。3.7.3 形态和表面成像。3.7.3.1 TEM：纳米囊泡呈光滑球形，均匀分散，无聚集迹象。3.7.3.2 光学显微镜：无染料甘油体多呈球形、尺寸分布较均匀且分散良好；罗丹明包载囊泡对比度增加并呈粉红色，未见聚集或结构改变，表明染料未损害囊泡完整性和稳定性。3.8 优化甘油体配方相容性研究。3.8.1 DSC：AMT和CAP分别在200.035 °C和63.581 °C显示明显吸热峰，AMT–CAP GMs仅见173.728 °C单一尖峰，对应甘露醇，其他峰缺失提示结晶态向无定形态转变并确认有效包封、无可见药物沉淀。3.8.2 FTIR：AMT和CAP主要特征吸收带在制剂中仍可检测，仅出现轻微波数位移、强度变化或变宽，无新共价化学实体形成，表明药物与辅料化学相容。3.8.3 XRD：AMT在18.54°、20.92°、22.98°有特征峰，CAP在11.71°、23.63°、29.73°有特征峰；AMT–CAP GMs中这些峰显著减少或消失，确认药物有效包封。3.9 体外药物释放研究：优化AMT–CAP GMs前4 h释放AMT 36.35 ± 1.20%、CAP 32.95 ± 1.66%，24 h释放AMT 78.10 ± 1.19%、CAP 75.71 ± 1.03%；药物混悬剂则快速释放。Higuchi模型拟合最佳，AMT和CAP的R²分别为0.9578和0.9709，表明释放为受控、扩散驱动和持续方式。3.10 AMT–CAP甘油体凝胶评价：凝胶呈光滑均匀质地，pH 6.2 ± 0.1，铺展性6.8 ± 0.3 cm，质构显示硬度229.90 g、一致性184.85 g s、黏聚性?157.21 g、黏聚功?92.31 g s，适合局部应用。3.10.1 甘油体纳米凝胶流变学：流变图显示剪切变稀假塑性，黏度从0.0995 s^?1时2.99 × 10⁶ mPa s降至100 s^?1时7627 mPa s，50 s^?1时动态黏度为13 858 mPa s，黏度降低约393倍，Carreau–Yasuda模型拟合良好，表明稳定性和铺展性平衡合适。3.10.2 质构分析：如上质构参数表明凝胶具有局部应用所需硬度、一致性、黏聚性和黏度指数。3.11 离体皮肤生物黏附：GM Gel 1%显示最高峰黏附力2.53 N和去黏附距离10.17 mm，表明较强初始黏附、延迟脱离和较长滞留时间；GM Gel 0.75%显示最高黏附功2.61 N s但峰力较低；0.5%和2%黏附较差或中等。3.12 离体皮肤渗透：AMT凝胶Q₂₄为363.64 ± 1.73 μg cm^?2，显著高于AMT混悬剂206.33 ± 2.85 μg cm^?2；CAP凝胶Q₂₄为329.86 ± 1.98 μg cm^?2，高于CAP混悬剂193.81 ± 2.42 μg cm^?2；AMT-F和AMT-S的稳态通量J_ss分别为6.78和3.01 μg cm^?2 h^?1，CAP-F和CAP-S分别为5.82和2.72 μg cm^?2 h^?1，凝胶通量增加约2.1–2.3倍，表明甘油体增强渗透。3.13 CLSM：罗丹明B染色的AMT–CAP GM凝胶处理皮肤后荧光强度增加，表皮渗透深度>39 μm；而罗丹明B水醇溶液仅渗透至18.5 μm，表明甘油体通过提高双层流动性和变形性、改善角质层水合和皮肤脂质流化而降低皮肤屏障。3.14 稳定性评估：6个月内4 °C及25 °C、RH 60% ± 5%下囊泡大小和包封效率变化有限，4 °C下外观澄清无分离；25 °C 6个月时轻微浑浊，粒径由初始150.2 ± 0.36 nm增至170.3 ± 1.25 nm，包封效率由87.45 ± 0.48%降至74.80 ± 0.95%，4 °C下6个月为157.9 ± 1.28 nm和81.60 ± 0.70%，表明制剂具有可接受稳定性。

讨论与结论部分总结：该研究将QbD、CCD统计建模和实验验证整合，系统理解磷脂、胆固醇和甘油浓度对囊泡大小、PDI及AMT/CAP包封效率的个体、交互和二次影响，优化出适合局部使用的甘油体纳米凝胶；流变和质构结果表明其具有适宜局部应用的流动和机械特性；体外、离体和CLSM研究共同显示改善的皮肤渗透性和局部递送潜力。研究结论翻译如下：所进行的研究结果表明，成功构建了用于局部递送AMT和CAP以改善痛性糖尿病周围神经病变的甘油体。甘油体的开发由质量源于设计（QbD）方法系统指导，使研究人员能够结构化理解重要制剂变量与甘油体系统关键质量特征之间的关系。采用中枢复合设计（CCD）研究自变量（磷脂、胆固醇和甘油）浓度对因变量（囊泡大小、PDI以及阿米替林和辣椒素包封效率）的个体、交互和二次影响。因此，基于QbD的实验设计、统计建模和实验验证的整合可为生产具有既定质量属性的甘油体纳米凝胶提供稳定基础。因此，所提出的AMT–CAP甘油体纳米凝胶是糖尿病周围神经病理性疼痛局部治疗的可行制剂平台。负载甘油体的纳米凝胶表现出适合局部使用的合理流动行为和质构特性。体外、离体和CLSM研究结果显示皮肤渗透性改善和局部递送潜力。因此，可以推断，研究人员所在实验室配制的AMT–CAP负载甘油体纳米凝胶在后续临床前和临床研究中显示出良好前景，以验证其缓解痛性糖尿病周围神经病变的功效。