外源褪黑素增强玉米耐涝性：与氧化还原、代谢及叶绿体响应的协同调控

《Plant Physiology and Biochemistry》：Exogenous melatonin enhances flooding tolerance in maize and is associated with coordinated redox, metabolic, and chloroplast responses

　　

极端降水事件的增加使涝渍胁迫（flooding stress, FS）成为制约玉米生产力和产量稳定性的重要因素。三叶期（V3）是植株快速营养生长的敏感时期，此期涝渍限制了根区氧气供应，抑制有氧呼吸，并扰乱水分和激素信号传导，进而降低地上部碳同化并改变代谢分配。过量激发能和呼吸失衡可促进活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累，引发膜损伤、细胞器损伤，最终限制生长和光合作用。涝渍诱导的根际低氧可迅速引发叶片ROS爆发。在正常条件下，ROS不仅是损伤分子，也是关键信号中间体。叶片ROS稳态取决于产生与清除之间的平衡。叶绿体（chloroplasts, Chl）、线粒体（mitochondria, MIT）和过氧化物酶体（peroxisomes, PE）是细胞内主要ROS来源，而质膜定位的呼吸爆发氧化酶同源物（respiratory burst oxidase homologs, RBOHs）可被胁迫和激素信号快速激活。RBOH以NADPH为电子供体，产生质外体超氧阴离子（O2-），随后转化为H2O2进行信号转导。然而，长期胁迫或代谢失衡可导致ROS过量积累，超出细胞清除能力，造成氧化损伤并激活细胞死亡相关过程。ROS解毒依赖于由酶促组分（如SOD、CAT、APX、GPX、GR、MDHAR、DHAR、GST）和非酶促抗氧化剂（如AsA、GSH、类黄酮和酚类物质）组成的协调抗氧化系统。其中，AsA-GSH循环作为核心氧化还原枢纽，调控H2O2解毒和胁迫信号。NADPH同时支持AsA-GSH循环中的还原性再循环和RBOH依赖性ROS产生，使NADP+/NADPH平衡成为FS下叶片氧化还原稳态的关键决定因素。在低氧条件下，丙酮酸被重新导向乳酸或乙醇发酵以再生NAD+并维持糖酵解，而复氧时则重新进入线粒体代谢。这一转变增加了电子传递压力和ROS产生，从而提高了解毒所需还原力的需求。脯氨酸代谢在FS下尤为重要，其积累和周转通过渗透调节和氧化还原缓冲调控ROS水平。当ROS产生超过解毒和修复能力时，细胞更易发生程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）。近期多项作物研究表明，外源褪黑素（melatonin, MT）——一种两亲性吲哚胺——可缓解FS诱导的损伤，其效应不仅限于ROS清除，还包括改善光合性能、增强膜稳定性和延缓衰老。尽管MT缓解涝渍相关损伤的证据日益增多，但玉米在FS下氧化还原、代谢、激素和叶绿体响应的协调机制仍未充分阐明。本研究旨在确定FS下MT相关的生理恢复是否伴随：（i）ROS/活性氮（reactive nitrogen species, RNS）积累减少、抗氧化活性和NADPH相关氧化还原响应变化；（ii）渗透调节、丙酮酸和发酵代谢变化；以及（iii）与水分状况和叶绿体完整性相关的激素谱和ZmPIP表达改变。该研究的一个关键优势是在共同的涝渍-MT实验框架内，将盆栽水平的生理和生化测量与转录组学、代谢组学、激素谱分析、叶绿体超微结构观察、定性TUNEL标记和成熟期产量估算相结合。研究人员假设MT处理与这些生理、代谢和细胞响应的协调恢复相关。因此，该研究旨在表征处理相关响应，而非推断因果代谢通量或建立FS×MT特异性分子机制。

论文解读

一、研究背景与意义

近年来，极端降水事件频发使涝渍胁迫成为制约玉米生产力和产量稳定性的重要非生物胁迫因素。玉米三叶期（V3）是植株快速营养生长的敏感窗口期，此阶段遭遇涝渍会限制根系氧气供应，抑制有氧呼吸，扰乱水分与激素信号传导，进而降低地上部碳同化能力并改变代谢分配格局。涝渍诱导的根际低氧可迅速引发叶片活性氧爆发，过量ROS积累超出细胞清除能力后，会造成膜脂过氧化、细胞器损伤，并激活细胞死亡相关进程，最终严重抑制生长和光合作用。

叶片ROS稳态取决于产生与清除的平衡。叶绿体、线粒体和过氧化物酶体是细胞内主要ROS来源，而质膜定位的呼吸爆发氧化酶同源物（RBOHs）可被胁迫和激素信号快速激活，以NADPH为电子供体产生质外体超氧阴离子。ROS解毒依赖于酶促抗氧化系统（SOD、CAT、APX、GPX、GR等）与非酶促抗氧化剂（AsA、GSH、类黄酮、酚类物质）的协同作用，其中AsA-GSH循环是核心氧化还原枢纽。NADPH同时参与AsA-GSH循环的还原性再循环和RBOH依赖性ROS产生，使NADP⁺/NADPH平衡成为决定叶片氧化还原状态的关键因素。低氧条件下，丙酮酸被重新导向乳酸或乙醇发酵以再生NAD⁺，而复氧时重新进入线粒体代谢，这一转变增加电子传递压力和ROS产生。脯氨酸代谢通过渗透调节和氧化还原缓冲参与ROS水平调控。当ROS产生超过解毒和修复能力时，细胞倾向于发生程序性细胞死亡（PCD）。

近年来，外源褪黑素（MT）作为一种两亲性吲哚胺类物质，在多种作物中被证实可缓解涝渍胁迫损伤，其效应涵盖ROS清除、光合性能改善、膜稳定性增强和衰老延缓。然而，玉米在涝渍胁迫下氧化还原代谢、发酵代谢、激素状态和叶绿体超微结构之间的跨层次协调机制仍不清晰，针对V3早期阶段的整合证据尤为有限。为此，研究人员在广西大学试验站开展了盆栽试验，以玉米品种桂单162为材料，采用完全随机2×2因子设计（CK、CK-MT、FS、FS-MT），在V3期实施5天涝渍处理，并通过叶面喷施100 μM褪黑素，系统整合了生理生化测定、转录组学、代谢组学、激素谱分析、叶绿体超微结构观察、TUNEL标记和成熟期产量评估，旨在阐明外源MT缓解玉米涝渍胁迫的多层次协调机制。

二、主要技术方法

本研究在广西大学试验站（南宁，22°50′N，108°17′E）温室自然光照条件下进行，供试品种为桂单162。试验采用2×2因子设计，设CK、CK-MT、FS、FS-MT四个处理，每处理3盆用于苗期测定，另设6盆用于产量测定。涝渍处理采用双套桶法在V3期维持土表以上2–3 cm水层5天。褪黑素以100 μM浓度于每日20:00叶面喷施，共5次。主要技术方法包括：LI-6800便携式光合仪测定气体交换和叶绿素荧光参数；分光光度法和商业试剂盒测定ROS/RNS含量、抗氧化酶活性、非酶促抗氧化剂含量、渗透调节物质含量及发酵代谢相关指标；Illumina平台RNA测序结合HISAT2比对和DESeq2差异表达分析；UHPLC-MS/MS非靶向代谢组学分析；UHPLC-MS/MS（QTRAP 6500+）靶向定量19种植物激素及相关代谢物；RT-qPCR验证9个差异表达基因；TUNEL荧光标记检测DNA片段化信号；透射电子显微镜观察叶绿体超微结构并测量形态参数；收获期测定产量及产量构成因子。

三、研究结果

外源褪黑素改善涝渍下玉米生长、光合性能和叶绿素荧光。 涝渍显著降低株高和叶面积，净光合速率（Pn）和 stomatal conductance（Gs）分别下降61.93%和77.98%，蒸腾速率（Tr）显著降低，Fv/Fm下降4.82%，非光化学淬灭（NPQ）增加42.23%。MT处理使Pn、Gs、Tr分别提高79.98%、155.58%和107.90%，Fv/Fm提高3.35%，NPQ降低16.39%，叶片相对含水量（RWC）提高10.22%。

外源褪黑素增强涝渍下抗氧化能力。 涝渍使O₂^-、H₂O₂和NO含量分别增加28.83%、194.15%和25.78%，SOD和CAT活性下降，POD活性升高，还原型AsA、总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）分别降低16.16%、48.21%和30.82%，还原型GSH增加70.45%，乳酸脱氢酶（LDH）活性增加27.18%。MT处理使H₂O₂和NO分别显著降低23.27%和12.67%，恢复SOD和CAT活性，POD和APX活性分别提高34.06%和78.28%，GSH和TPC分别增加23.97%和20.71%，LDH活性下降16.24%。

外源褪黑素改善渗透调节。 涝渍使可溶性糖含量增加97.47%，可溶性蛋白和脯氨酸含量分别降低41.98%和31.91%。MT处理使可溶性糖含量显著降低26.70%，脯氨酸显著增加，可溶性蛋白数值上升。

探索性多变量分析揭示处理相关的生理性状模式。 PCA分析中PC1和PC2分别解释52.10%和20.20%的总方差，FS样本聚集于H₂O₂、O₂^-、LDH、NO和NPQ附近，FS-MT样本则趋向RWC、茎粗、APX、POD、TFC和还原型GSH。相关分析显示H₂O₂和O₂^-与生长和光合性状呈负相关，与NPQ、LDH和NO呈正相关。

涝渍和褪黑素重塑激素谱。 涝渍显著降低IAA、内源MT、tZR、JA、L-Phe和ABA含量，增加Indole、TRA、IBA、ILA和GA8。MT处理使内源MT增加650.13%，Indole降低61.68%，ABA增加22.92%，IP增加357.24%，SA增加138.10%，JA增加94.83%，DHZ增加85.24%，GA1增加233.07%。

涝渍下褪黑素的转录组响应。 RNA-seq共获得64.59 Gb高质量数据。FM162 vs F162比较鉴定出4099个差异表达基因（DEGs），其中1365个上调、2734个下调。KEGG富集分析显示DEGs主要涉及胁迫响应、信号转导、代谢途径、碳氮代谢和光合作用，MAPK信号、植物激素信号转导、谷胱甘肽代谢和淀粉蔗糖代谢在多个比较中显著富集。

涝渍下褪黑素的代谢组响应。 经质量控制后保留3689个注释代谢物。F162 vs W162鉴定出417个差异积累代谢物（DAMs），其中145个增加、272个减少。DAMs主要与碳水化合物、氨基酸、脂质、抗氧化和解毒相关代谢过程有关。

转录组与代谢组整合分析。 九象限图显示转录本与代谢物之间存在协调变化模式。整合KEGG分析表明，F162 vs W162中差异转录本主要映射至碳代谢（38个）、谷胱甘肽代谢（36个）和TCA循环（32个）；FM162 vs F162中甘油磷脂代谢（17个）和牛磺酸及次牛磺酸代谢（14个）富集最显著；FM162 vs W162中碳代谢（52个）和TCA循环（49个）再次呈现最高转录本代表数。

抗氧化相关生理与分子模式。 涝渍显著降低NADP⁺和丙酮酸含量，NADPH含量增加。MT处理进一步降低NADP⁺，显著增加NADPH和丙酮酸。涝渍下调ZmSOD、ZmCAT2、ZmAPX6、ZmGRX4/7、ZmGPX4/6和ZmPRX等抗氧化基因，FS-MT下这些基因转录丰度高于FS。ZmRBOHC和ZmRBOHF-2在涝渍下被诱导，FS-MT下降低或恢复至CK水平。ZmPIP2;4、ZmPIP1;5、ZmPIP2;6、ZmPIP1;3和ZmPIP2;1在涝渍下受抑制，FS-MT下转录丰度升高。透射电镜显示涝渍导致细胞收缩、细胞壁变薄、液泡膜破裂、叶绿体肿胀、基粒排列紊乱、嗜锇颗粒增加、线粒体肿胀和淀粉粒积累。FS-MT下液泡完整性、叶绿体被膜和基粒组织保存更好，嗜锇颗粒和淀粉粒减少。形态测量显示FS-MT下叶绿体长度和宽度均显著高于FS。

渗透和发酵变化伴随FS-MT下更弱的细胞损伤信号。 涝渍诱导ZmPGM1表达，FS-MT进一步增强；ZmPGM2和ZmPGM3在涝渍下下调且FS-MT下仍较低，ZmPGM4在涝渍下下调但FS-MT下恢复。ZmPFP和ZmENO1在FS-MT下相对表达高于FS。ZmLDH转录丰度在涝渍下最高，FS-MT下降低。涝渍增加乙醇积累和ADH、PDC蛋白丰度，FS-MT下乙醇较FS降低13.86%，PDC活性高于FS。胆碱在涝渍下增加，FS-MT下恢复至CK水平。甜菜碱在涝渍下增加，FS-MT下进一步增加。α-酮戊二酸在涝渍下显著降低，FS-MT下显著增加。TUNEL标记显示CK下荧光最弱，FS下信号增强（尤其表皮和叶肉细胞），FS-MT下信号视觉上减弱。

RT-qPCR验证。 9个选定基因的RT-qPCR表达模式与RNA-seq数据一致，独立验证了相应转录组表达模式。

涝渍下褪黑素的产量响应。 涝渍使穗粗、粒数和百粒重分别降低10.66%、19.90%和12.17%，秃尖长度增加，预测籽粒产量较CK下降15.80%。MT处理使穗粗和粒数分别增加9.60%和25.05%，秃尖长度降低，预测籽粒产量较FS增加18.24%。正常水分条件下，CK-MT的百粒重和预测产量分别较CK低20.58%和9.00%。

四、讨论与结论

讨论部分指出，涝渍通过限制根区氧气供应抑制光合作用并增加氧化压力，外源MT通过增强酶促和非酶促抗氧化系统协同作用、改善渗透调节和代谢稳定性，缓解了涝渍诱导的氧化损伤。MT处理改变了涝渍下的激素稳态，内源MT、ABA、JA及多种细胞分裂素和赤霉素相关代谢物水平升高，与叶片水分状况、光合和氧化还原性状的变化共同发生。叶绿体超微结构观察表明，MT处理改善了涝渍下叶绿体形态和结构完整性，与较高的Fv/Fm和较低的氧化负担一致。NADPH相关代谢变化、抗氧化响应、ZmPIP表达改变、RWC提高和氧化负担降低共同伴随MT相关的生理改善。发酵代谢方面，MT处理下乙醇积累减少、PDC活性提高、ZmLDH转录丰度降低，表明发酵压力减轻。TUNEL信号减弱与糖酵解、发酵、相容性溶质代谢和氨基酸相关途径的变化共同发生。产量方面，V3期涝渍显著降低预测产量和多个产量性状，而MT处理通过提高粒数和缩短秃尖长度使预测产量较FS增加18.24%。

研究结论表明，外源褪黑素通过协调氧化还原代谢、抗氧化防御、渗透调节、激素稳态和叶绿体结构保护等多层次响应，显著缓解玉米V3期涝渍胁迫损伤，最终实现产量恢复。该研究为理解褪黑素缓解玉米涝渍胁迫的多层次协调机制提供了整合性证据，也为涝渍胁迫下玉米的田间管理策略提供了理论参考。