张力驱动的牙周膜成纤维细胞糖酵解–H3K18乳酸化轴调控免疫微环境与正畸牙移动中的牙槽骨改建

《International Journal of Oral Science》：H3K18la in periodontal ligament fibroblasts regulates immune niches and alveolar bone remodeling under mechanical loads

　　

牙槽骨的代谢与改建高度活跃，能够动态响应机械力。然而，牙槽骨如何响应机械力的机制仍不清楚。正畸本质上是一个机械力驱动的牙槽骨改建的生理过程。本研究发现，正畸张力促进牙周膜（PDL）成纤维细胞中糖酵解相关基因的表达。机械激活的糖酵解随后增强了PDL成纤维细胞中组蛋白H3第18位赖氨酸的乳酸化修饰（H3K18la）。CUT&Tag分析显示，H3K18la富集于CXCL1的启动子区域以上调其转录。3PO抑制糖酵解并减弱了PDL成纤维细胞中拉伸力诱导的H3K18la和CXCL1水平。CXCL1随后增强巨噬细胞中的氧化磷酸化并促进M2巨噬细胞极化。此外，通过牙周注射3PO在体内抑制糖酵解，破坏了CXCL1介导的CXCR2+巨噬细胞浸润，并抑制了正畸牙移动（OTM）过程中的骨形成。进一步地，利用Cxcr2基因敲除（Cxcr2–/–）小鼠在体内阻断CXCL1/CXCR2轴，损害了PDL中张力诱导的M2巨噬细胞极化，破坏了正畸牙移动过程中有利于骨形成的促消退微环境。总之，研究结果表明，PDL成纤维细胞中张力诱导的糖酵解–H3K18la轴在建立促消退的牙周免疫微环境和促进正畸牙移动过程中的牙槽骨形成方面发挥关键作用。

论文解读

一、研究背景与科学问题

骨组织根据Wolff定律适应机械力刺激，适当的力学载荷可增强骨量与骨强度，而力学刺激缺失则导致骨量流失。在骨骼系统中，牙槽骨因咬合机械刺激而具有高度活跃的代谢与改建特性。正畸治疗本质上是机械力驱动的牙槽骨改建过程，其核心机制涉及力学信号如何转化为生物学信号从而启动骨重塑。然而，机械力调控牙槽骨改建的具体机制仍不清楚。

近年研究揭示，无菌性免疫应答在正畸牙移动（orthodontic tooth movement, OTM）引发的牙槽骨改建中发挥关键作用，多种细胞在牙周微环境中协同调控骨吸收与骨沉积。牙周膜（periodontal ligament, PDL）成纤维细胞作为PDL的主要基质细胞，既是正畸牙移动过程中的主要力学感受细胞，也是调控力学诱导免疫应答的关键效应细胞。然而，PDL成纤维细胞如何感知机械力并启动无菌性炎症以驱动牙槽骨改建，其分子机制尚不明确。

机械刺激是细胞代谢的重要调节因素，近期研究已报道力学调控糖酵解以满足细胞能量需求。糖酵解的终产物内源性乳酸可通过将乳酸基团连接至赖氨酸残基（即“组蛋白乳酸化”），将细胞代谢与表观遗传调控联系起来。然而，PDL成纤维细胞中机械力与细胞代谢–表观遗传改变之间的关联仍缺乏研究。基于此，该研究旨在探究正畸张力如何通过PDL成纤维细胞的代谢–表观遗传重编程调控牙周免疫微环境与牙槽骨改建。

二、研究设计与主要技术方法

该研究综合运用多种技术手段。在动物模型方面，研究者在8周龄雄性野生型小鼠及Cxcr2基因敲除（Cxcr2^–/^–）小鼠上建立正畸牙移动模型，在上颌第一磨牙与切牙之间放置20 g镍钛螺旋弹簧持续7天。在细胞实验方面，研究人员从青少年（12–14岁）拔除的前磨牙牙根中1/3刮取牙周组织分离培养人PDL成纤维细胞，并从小鼠长骨中分离培养骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDMs）。主要技术方法包括：单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析小鼠牙周组织细胞图谱；Flexcell体外循环拉伸加载系统模拟正畸张力；Seahorse XF分析仪实时检测糖酵解速率（glycoPER）与线粒体耗氧率（OCR）；CUT&Tag技术检测H3K18la全基因组结合位点；Western blot、免疫荧光、流式细胞术检测蛋白表达与细胞极化；ELISA检测CXCL1分泌水平；RNA测序分析巨噬细胞转录组变化；Micro-CT评估牙槽骨形态计量学参数；TRAP染色检测破骨细胞。

三、研究结果

正畸力诱导PDL成纤维细胞糖酵解。 通过scRNA-seq分析，研究人员发现OTM组PDL成纤维细胞中糖酵解相关基因（Pkm、Pfkfb3、Pfkp、Hk2、Pfkm、Eno1）表达上调，GO富集分析显示糖酵解相关生物学过程显著富集。免疫荧光染色证实张力侧PDL中PKM2和PFKFB3蛋白水平在OTM组显著升高，且张力侧高于压缩侧。

张力激活的糖酵解诱导PDL成纤维细胞组蛋白乳酸化。 体外实验显示，循环拉伸24小时增强人PDL成纤维细胞的糖酵解速率，上调PKM2、PFKFB3、PFKM等糖酵解酶表达，并增加乳酸积累。拉伸力加载12小时和24小时后，细胞整体乳酸化水平显著升高，H3K18la水平呈相同趋势，而H3K9la无显著变化。体内实验同样证实OTM组张力侧PDL中H3K18la水平升高。

H3K18la调控PDL成纤维细胞中CXCL1转录。 CUT&Tag分析显示，拉伸力处理后人PDL成纤维细胞H3K18la在转录起始位点（TSS）附近结合信号显著增强，靶基因富集于趋化因子信号通路等炎症相关通路。其中CXCL1启动子区域H3K18la富集程度显著增加，qRT-PCR验证CXCL1 mRNA表达上调最为显著。外源性乳酸处理可增加H3K18la和CXCL1水平，而糖酵解抑制剂3PO预处理则抑制拉伸力诱导的H3K18la和CXCL1表达及分泌。

PDL成纤维细胞来源的CXCL1通过线粒体呼吸促进M2巨噬细胞极化。 流式细胞术和免疫荧光显示，CXCL1处理促进BMDMs中CD206（M2标志物）表达。共培养实验表明，与拉伸力处理的PDL成纤维细胞共培养的BMDMs表达更高水平的CD206，而CXCR2拮抗剂SB225002预处理可抑制这一效应。RNA测序显示CXCL1上调BMDMs中线粒体氧化磷酸化相关基因（mt-Atp6、mt-Nd1、mt-Nd2、Prkag3），Seahorse分析证实CXCL1增强基础呼吸和最大呼吸能力及ATP生成。

抑制H3K18la破坏正畸力诱导的免疫应答。 体内牙周注射3PO抑制了OTM诱导的H3K18la和CXCL1表达，减少了张力侧牙槽骨沉积（BV/TV和Tb.Th降低、Tb.Sp增加），并减少了颈部淋巴结和PDL微环境中F4/80⁺CXCR2⁺巨噬细胞浸润，同时抑制OCN（骨钙素）表达。

阻断CXCL1/CXCR2轴损害正畸力引导的骨改建。 在Cxcr2 KO小鼠OTM模型中，张力侧骨沉积受损，PDL中F4/80⁺CD206⁺ M2巨噬细胞比例降低，OCN⁺细胞减少而TRAP⁺破骨细胞增多，表明阻断该轴破坏了促消退微环境和骨形成。

四、讨论与结论

讨论部分指出，PDL成纤维细胞中张力诱导的糖酵解–H3K18la–CXCL1轴通过促进M2巨噬细胞极化建立促消退免疫微环境，从而促进牙槽骨形成。该研究将机械力感受、细胞代谢、表观遗传调控与免疫调节联系起来，为理解正畸牙移动中的骨改建机制提供了新视角。研究同时指出，组蛋白乳酸化是力学诱导表观遗传网络的一部分，可能与其他组蛋白修饰协同作用。CXCL1/CXCR2轴在不同组织微环境中功能具有情境依赖性。研究也承认若干局限性，包括二维拉伸模型与体内复杂力学环境的差异、3PO的脱靶效应、Cxcr2非巨噬细胞特异性表达等，未来需采用细胞类型特异性遗传学方法进一步验证。

研究结论： 正畸张力在PDL成纤维细胞中诱导糖酵解和H3K18la，从而上调CXCL1表达，促进巨噬细胞氧化磷酸化和M2巨噬细胞极化，最终促进牙槽骨沉积。这些发现为正畸牙移动相关的机械转导机制提供了新见解，可能有助于开发增强牙槽骨再生的治疗策略。该论文发表于《International Journal of Oral Science》。