靶向致癌性microRNA-221的CPP-PNA偶联物的设计、合成与生物物理表征

《Journal of Peptide Science》：Design, Synthesis and Biophysical Characterisation of CPP-PNA Conjugates for Targeting Oncogenic microRNA-221

　　

肽核酸（PNA）因其高结合亲和力、优异的序列特异性和对酶降解的抗性，成为靶向疾病相关微小RNA（microRNA）的有前景平台。然而，其治疗应用常因细胞摄取效率低下而受限。本研究展示了靶向致癌性microRNA miRNA-221-5p的细胞穿透肽（CPP）-PNA偶联物的设计、合成与理化表征，及其初步生物学评价。通过固相肽合成法合成了经功能化修饰、可通过铜(I)催化叠氮-炔环加成（CuAAC）或二硫键介导偶联与CPP连接的抗miRNA-221-5p PNA。圆二色光谱和紫外熔解分析证实了与miRNA-221-5p形成稳定、序列特异性的PNA-RNA异源双链体。与乱序对照序列相比，该双链体展现出强杂交能力和高热力学稳定性。细胞增殖实验表明，CPP-PNA偶联物与氯喹共孵育时表现出适度但可重复的抗增殖效应，且无急性细胞毒性证据。这些发现强调了CPP-PNA系统用于细胞内递送反义制剂的潜力，并揭示了连接子性质在决定其生物学性能中的重要性。

研究背景、现存问题与研究意义

微小RNA（miRNA）是一类长约17-22个核苷酸的非编码RNA，通过在转录后水平调控基因表达，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程。miRNA的表达失调与多种人类疾病尤其是癌症的发生发展密切相关，其中部分miRNA可作为癌基因发挥作用。miRNA-221属于miRNA-221/222簇，在非小细胞肺癌等多种实体瘤中频繁过表达。它通过抑制PTEN、CDKN1B（p27^Kip1）、CDKN1C（p57^Kip2）和SOCS家族蛋白等肿瘤抑制基因，激活PI3K/Akt和JAK/STAT等促存活信号通路，从而促进恶性转化、血管生成、上皮-间充质转化（EMT）、转移扩散和化疗耐药。因此，miRNA-221被认为是基于核酸的抗癌策略的理想靶点。

目前已探索了多种反义技术来抑制致癌性miRNA，包括修饰寡核苷酸、锁核酸（LNA）和小干扰RNA（siRNA），但这些方法在稳定性、特异性和胞内递送方面仍存在问题。肽核酸（PNA）是一种合成的核酸类似物，其天然糖-磷酸骨架被中性的聚酰胺骨架取代。这种独特结构赋予PNA对互补DNA或RNA序列的高结合亲和力、出色的核酸酶和蛋白酶抗性以及良好的化学稳定性。然而，PNA的治疗应用受限于其较差的细胞摄取能力，这主要是由于其骨架缺乏电荷基团且固有膜通透性低。

为此，研究人员开展了本项研究，旨在开发靶向致癌性miRNA-221-5p的细胞穿透肽（CPP）-PNA偶联物，并通过整合两种互补的偶联化学方法（CuAAC点击化学和二硫键介导偶联）与详细的理化表征及初步生物学评价，探究不同连接子化学性质对偶联物稳定性和生物学性能的影响，为基于PNA的治疗药物理性设计提供新见解。

关键技术方法

研究人员采用固相肽合成（SPPS）法分别合成了PNA寡聚体和CPP。通过两种偶联策略制备CPP-PNA偶联物：（1）Cu(I)催化叠氮-炔环加成（CuAAC）反应，将炔基功能化的PNA与叠氮修饰的CPP连接，形成稳定的三唑连接子；（2）二硫键交换反应，将半胱氨酸功能化的PNA与含活化半胱氨酸残基的CPP连接，形成可逆的二硫键。利用圆二色（CD）光谱进行构象研究，通过紫外（UV）熔解分析测定热稳定性。在A549人肺癌细胞系中进行细胞增殖实验（CCK-8法）和荧光定量细胞摄取效率检测。

研究结果

3.1 抗miRNA-221-5p PNA构建体的设计与合成

研究人员设计了与miRNA-221-5p互补的反义PNA序列，并在C端引入两个赖氨酸残基以提高水溶性，在N端引入5-己炔酸提供末端炔基功能。针对合成过程中出现的聚集问题，优化了基于哌嗪/DBU的去保护策略和高稀释条件，显著提高了粗品PNA的产率和纯度。同时合成了N端带半胱氨酸的PNA类似物用于二硫键偶联，以及作为阴性对照的乱序PNA序列。

3.2 荧光标记CPP的合成

选择阳离子型Tat肽和两亲性Penetratin肽（PNT，其中Met替换为正亮氨酸以避免氧化），在其N端标记羧基荧光素（CF）用于荧光监测细胞摄取，C端引入叠氮基团用于点击化学偶联。研究发现，含半胱氨酸的CPP衍生物在Rink酰胺树脂上合成不稳定，将其转移到2-氯三苯甲基氯树脂（2-CTC）后成功解决了该问题。

3.3 CuAAC介导的CPP-PNA偶联物形成

通过CuAAC点击化学反应，在CuSO₄和抗坏血酸钠存在下，于H₂O/t-BuOH混合溶剂中将炔基功能化PNA与叠氮修饰CPP高效偶联，所得三唑连接子化学性质稳定且耐酶解。

3.4 二硫键连接的CPP-PNA偶联物

利用2,2-二硫二吡啶（DTNP）活化CPP的半胱氨酸残基生成混合二硫键中间体，再与含半胱氨酸的PNA通过硫醇-二硫键交换反应在温和条件下偶联。该策略产率较低，但二硫键的可逆性有利于在胞内还原环境中释放PNA。

3.5 圆二色光谱的结构表征与miRNA-PNA相互作用

游离miRNA-221-5p的CD谱呈现典型右手螺旋RNA特征。加入互补抗miRNA-221-5p PNA后，光谱发生显著变化：260 nm附近正带强度增加并蓝移，220 nm附近椭圆率增强，且实验光谱与两条单链光谱的加和明显偏离，表明形成了有序的PNA-RNA异源双链体。而乱序PNA与miRNA共孵育后光谱几乎不变，证明结构变化源于特异性Watson-Crick碱基配对。

3.6 miRNA-PNA双链体的热稳定性

热变性实验显示，游离miRNA-221-5p的熔解温度（T_m）为53°C。与互补抗miRNA-221-5p PNA杂交后，T_m升至72°C，比游离RNA高出近20°C，体现了PNA中性骨架消除静电排斥带来的高结合亲和力。乱序PNA与miRNA形成的双链体T_m仅为62°C，仅略高于游离miRNA，表明其未能形成完全互补的双链体。

3.7 靶向miRNA-221-5p的CPP-PNA偶联物的生物学评价

3.7.1 CPP-PNA偶联物的抗增殖活性

在A549细胞中评估了偶联物（5 μM）的细胞活力。1小时处理后所有偶联物均未引起急性膜毒性（细胞活力>80%）。单独偶联物在48小时内未诱导显著抗增殖效应。与氯喹（150 μM）共孵育后，CF-Tat-(三唑)-PNA-NH₂和CF-PNT-S-S-PNA-NH₂在48小时后使肿瘤细胞数量减少约50%，CF-Tat-S-S-PNA-NH₂减少35%，而CF-PNT-(三唑)-PNA-NH₂无显著活性。这表明连接子性质和CPP序列共同决定了生物学性能，二硫键在Penetratin体系中更有利，而三唑键在Tat体系中更优。

3.7.2 CPP-PNA偶联物细胞摄取效率的定量分析

荧光定量分析显示四种偶联物均能被A549细胞摄取，但效率差异显著。CF-PNT-(三唑)-PNA-NH₂的摄取效率最高，其次为CF-Tat-(三唑)-PNA-NH₂，而两种二硫键连接偶联物的胞内水平明显较低。值得注意的是，定量摄取值与抗增殖活性不完全相关，说明细胞摄取不等于生物利用度，后续的内体逃逸和胞内转运同样关键。

总结与结论

本研究建立了合成、表征、定量细胞摄取和初步生物学评价CPP-PNA偶联物的方法论基础。光谱学证实设计的PNA序列能选择性识别靶miRNA并形成稳定、序列特异的异源双链体。生物学研究表明，CF-Tat-(三唑)-PNA-NH₂和CF-PNT-S-S-PNA-NH₂在氯喹存在下对A549细胞产生约50%的抗增殖效应，且无急性毒性。内部化数据表明Tat和PNT均能介导PNA摄取，但胞内活性还取决于内体逃逸等后续事件。研究强调连接子在决定特定CPP构建体生物学性能中的关键作用。未来将探索包含Trp丰富内体逃逸结构域或寡聚His质子海绵效应的杂合载体，以增强胞浆递送效率。这些发现为设计基于肽的核酸治疗递送系统提供了重要见解，支持了CPP-PNA偶联物作为靶向和调控致癌性microRNA通路的潜在工具。