《Oncogene》：Nuclear cathepsin L induces DNA damage by regulating DNA repair factors in ovarian cancer
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对PARP抑制剂（PARPi）的耐药性是卵巢癌（OC）临床面临的主要挑战，凸显了开发新策略以提高治疗效果的必要性。研究人员既往工作揭示，抗疟药物阿的平（QC）可通过促进溶酶体释放活性组织蛋白酶L（CTSL）来重用于诱导OC细胞死亡。基于这些发现，研究人员探究了
对PARP抑制剂（PARPi）的耐药性是卵巢癌（OC）临床面临的主要挑战，凸显了开发新策略以提高治疗效果的必要性。研究人员既往工作揭示，抗疟药物阿的平（QC）可通过促进溶酶体释放活性组织蛋白酶L（CTSL）来重用于诱导OC细胞死亡。基于这些发现，研究人员探究了QC激活的CTSL是否影响OC细胞的DNA损伤和同源重组（HR）修复。实验证据表明，QC激活的CTSL下调关键DNA修复蛋白RAD51和53BP1，导致HR修复受损并增加DNA损伤。重要的是，CTSL的基因敲低显著减少了QC诱导的DNA损伤，证实CTSL在此过程中发挥直接功能作用。研究人员还发现，QC与PARPi联合治疗的反应在不同模型中存在差异。在反应性患者来源腹水（PDA）和患者来源异种移植（PDX）球体中，CTSL易位至细胞核（nCTSL）。相反，非反应性模型中不存在核CTSL。机制上，QC无法抑制非反应性细胞中的CRM1/XPO1核输出受体，导致CTSL持续从细胞核输出。为解决此问题，研究人员使用了CRM1抑制剂KPT-8602，它恢复了CTSL的核滞留，从而增强了与PARPi的治疗协同作用，并克服了QC处理的PDA 3D球体中的耐药性。与这些发现一致的是，QC在细胞源性OVCAR-5异种移植和PDX-PH070模型中均减轻了肿瘤负荷，这两个模型均显示出QC诱导的nCTSL，但在非反应性PDX-PH095模型中则未观察到。然而，在其他非反应性PDX模型（PH747和PH081）中，QC与KPT-8602联合治疗显著降低了肿瘤负荷。总之，研究结果证实了核CTSL在QC诱导的DNA损伤中的关键作用，并将nCTSL确定为治疗反应的潜在预测性生物标志物。这些结果表明，将QC与PARPi或CRM1抑制剂联合使用是克服OC中PARPi耐药性的一种有前景的策略。
研究背景与科学问题
卵巢癌（Ovarian Cancer, OC）是最致命的妇科恶性肿瘤之一，多数患者在确诊时已处于晚期。尽管聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂（PARP inhibitors, PARPi）在伴有同源重组修复（Homologous Recombination Repair, HRR）缺陷或BRCA突变的患者中取得了显著疗效，但原发性和获得性耐药仍是临床面临的重大挑战。因此，寻找新的预测性生物标志物和联合治疗策略以克服PARPi耐药性至关重要。既往研究表明，抗疟老药阿的平（Quinacrine, QC）可被重新利用于抗癌治疗，其通过诱导溶酶体膜通透化（Lysosomal Membrane Permeabilization, LMP）和线粒体外膜通透化（Mitochondrial Outer Membrane Permebilization, MOMP），上调并激活组织蛋白酶L（Cathepsin L, CTSL），进而导致OC细胞死亡。然而，QC激活的CTSL是否参与DNA损伤应答以及如何调控同源重组（HR）修复通路尚不清楚，这构成了本研究的核心科学问题。
研究方法概述
本研究综合运用了多种分子与细胞生物学技术。包括：利用shRNA敲低和过表达手段调控CTSL表达水平以验证其功能；采用碱性彗星实验评估DNA损伤程度；通过亚细胞分级分离结合免疫印迹法检测核CTSL（nuclear CTSL, nCTSL）及DNA修复蛋白的表达变化；利用重组蛋白体外降解实验验证CTSL对靶蛋白的直接切割作用；通过Loewe协同效应模型评价药物联用效果。体内实验方面，研究人员建立了细胞系源性异种移植模型（OVCAR-5）和多例患者源性异种移植（Patient-Derived Xenograft, PDX）模型（PH095、PH070、PH747、PH081），并对患者来源腹水细胞（Patient-Derived Ascites, PDA）进行了离体球体培养。其中PDX肿瘤细胞由梅奥诊所提供。
研究结果
1. 阿的平通过CTSL促进DNA损伤并抑制修复通路
研究人员首先在OC细胞系中发现，QC处理剂量依赖性地增加了彗星尾矩，表明诱导了显著的DNA损伤，同时伴随DNA修复蛋白53BP1和RAD51的下调以及γH2AX和CTSL的上调。在C13和OVCAR5细胞中敲低CTSL后，QC诱导的DNA损伤显著减弱，γH2AX水平降低，而53BP1和RAD51水平恢复。反之，在低表达CTSL的OV2008和OVCAR7细胞中过表达CTSL则增强了QC诱导的DNA损伤。进一步地，重组人CTSL（rCTSL）可直接降解未经处理的细胞裂解液中的53BP1和RAD51，且这一效应可被CTSL特异性抑制剂所逆转，而组织蛋白酶B（CTSB）无此作用。以上结果表明，QC通过上调CTSL介导DNA损伤和HR修复抑制。
2. QC与PARPi在OVCAR5异种移植模型中表现出协同效应
在OVCAR5细胞源性异种移植小鼠模型中，QC单药或与PARPi（rucaparib）联合用药均显著抑制了肿瘤生长、减少了肿瘤重量和腹水体积，联合组效果优于任一单药组。肿瘤组织分析显示QC诱导了活性CTSL和γH2AX，并降低了RAD51和53BP1水平，彗星实验也证实了DNA损伤的增加。
3. QC与PARPi联合治疗在患者来源腹水细胞中呈现差异性应答
研究人员在8例PDA样本中测试了QC与PARPi的联合效应，发现其中4例（OVA-1, 2, 8, 10）表现为协同作用（敏感型），另4例（OVA-3, 4, 9, 11）表现为拮抗作用（耐药型）。值得注意的是，所有样本中QC均能上调活性CTSL，提示CTSL的总量变化并非决定联合疗效的关键因素。
4. 核CTSL是QC联合PARPi治疗反应的生物标志物
通过活细胞成像和亚细胞分级分离，研究人员发现，在敏感型PDA中，QC诱导的活性CTSL主要定位于细胞核（nCTSL），而在耐药型PDA中，CTSL活性仅局限于胞浆。相应地，只有敏感型PDA（如OVA-2）在QC处理后表现出明显的DNA损伤，耐药型PDA（如OVA-3）则无此现象。此外，在OVCAR5细胞中敲低CTSL后，QC与rucaparib的协同效应转变为拮抗效应，进一步证实nCTSL是协同作用所必需的。
5. QC差异性调控CRM1水平
研究发现，QC在敏感型PDA（OVA-1）中下调核输出蛋白CRM1（染色体区域维护蛋白1，由XPO1基因编码），从而促进CTSL在核内滞留；而在耐药型PDA（OVA-3）中，QC反而上调CRM1，导致CTSL无法入核。当使用CRM1抑制剂KPT-8602联合QC处理耐药型OVA-3细胞时，CRM1被成功抑制，nCTSL得以保留，并伴随53BP1和RAD51的下调以及DNA损伤和细胞凋亡的增加。在PDX离体培养中也观察到了类似的CRM1与nCTSL表达模式。
6. 体内验证QC联合KPT-8602的抑瘤效果
在QC不敏感的PDX模型PH747和PH081中，QC单药或KPT-8602单药均不能有效抑制肿瘤生长。然而，QC与KPT-8602联合治疗显著缩小了肿瘤体积，延长了荷瘤小鼠的生存期（PH747达76天，PH081达64天）。肿瘤组织的亚细胞组分分析证实，联合治疗组中KPT-8602有效降低了CRM1，促进了QC诱导的nCTSL核滞留，进而降低了53BP1和RAD51水平，并增加了γH2AX信号。
讨论与结论
本研究的核心发现是，QC通过诱导CTSL向细胞核易位（nCTSL），使其能够降解关键的DNA修复蛋白RAD51和53BP1，从而抑制HR修复并造成DNA损伤，最终增强OC细胞对PARPi的敏感性。研究首次揭示了QC–CRM1–nCTSL轴在调控治疗响应中的作用：在敏感模型中，QC通过下调CRM1促使nCTSL滞留；而在耐药模型中，QC无法抑制甚至上调CRM1，导致CTSL被排出核外，这是联合治疗失败的主要原因。通过引入CRM1抑制剂KPT-8602，可以有效逆转这一耐药机制，恢复nCTSL的功能并实现协同杀伤效应。这一发现在多个PDA和PDX模型中得到了体内外一致性验证。
研究人员得出结论：药物诱导的nCTSL可作为预测OC患者对QC联合PARPi或CRM1抑制剂治疗反应的潜在生物标志物，无论其HRD、BRCA或p53突变状态如何。QC与KPT-8602的联合方案为克服PARPi耐药性提供了新的治疗策略。未来需要在大规模遗传多样性的患者群体中进行进一步的临床验证，并深入探究QC差异性调控CRM1水平的分子机制。
