纳米路线结合DFT、分子对接、ADMET与SAR的吡喃功能化嘧啶骨架作为强效抗Rhizoctonia solani候选杀菌剂

《Scientific Reports》：Nano route with DFT, docking studies, ADMET, and SAR of a pyran-functionalized pyrimidine scaffold as a potent Rhizoctonia solani

　　

多种被称为植物病原真菌（phytopathogenic fungi）的植物侵染可导致广泛的农业病害。近期研究聚焦于开发、合成和评价吡喃连接嘧啶杂合体（pyran-linked pyrimidine hybrids）作为潜在抗真菌剂。在本研究中，吡喃功能化嘧啶骨架（pyran-functionalized pyrimidine scaffold）的目标杂合体通过基于纳米科学（nanoscience）的技术进行优化合成。一个涉及亲核取代反应（nucleophilic substitution reaction）、环化（cyclization）、乙酰化（acetylation）、水解（hydrolysis）、缩合（condensation）和Dimroth重排（Dimroth rearrangement）的多步过程制得吡喃-嘧啶杂合体1–7。本研究采用全面的计算方法，评估优化合成化合物（3、5和6）对植物病原真菌Rhizoctonia solani多种治疗靶点的抗真菌效力。所研究的杂合体，尤其3、5和6在20 ppm和50 ppm时，对真菌Rhizoctonia solani表现出强抵抗性，代表了一种针对土传植物病原体的潜在抗真菌防治策略。分子对接分析显示，这些化合物表现出强效的多靶点结合亲和力，并经常优于参考药物氟康唑（fluconazole），尤其是针对甾醇-14-α-脱甲基酶（sterol-14-α-demethylase）、几丁质合成酶（chitin synthase）、纤维素合成酶（cellulose synthase）和细胞色素bc₁（cytochrome bc₁）。针对化合物3的轨迹进行分子动力学（molecular dynamics）模拟以及MM-GBSA（Molecular Mechanics/Generalized Born Surface Area）/PBSA（Poisson-Boltzmann Surface Area）自由能计算，证实形成了高度稳定且动力学可行的复合物。根据药代动力学和ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）评估，测试的杂合体符合公认的药物相似性规则（Lipinski、Pfizer和Golden Triangle），并呈现最低的细胞色素P450（cytochrome P450）抑制风险。基于计算分析结果，并结合确认的真菌效力评价，优化合成化合物是开发有效杀菌剂的有前景生物活性候选物。本研究首次在计算分析支持下比较吡喃功能化嘧啶对Rhizoctonia solani的保护作用。

植物病害是威胁世界粮食安全的主要挑战之一。植物病原真菌（phytopathogenic fungi）可引起广泛的农业病害，其中Rhizoctonia solani是土传真菌病原体，对全球多种作物造成严重病害，作物损失可达50%，每年造成数百万美元经济损失。传统防治主要依靠化学杀菌剂，但存在环境污染、病原菌抗性及健康危害等问题。嘧啶（pyrimidine）是二氮杂环骨架，具有抗癌、抗菌、抗结核和抗疟等生物活性，并与5-氟尿嘧啶（5-Flu，5-fluoro-1H,3H-pyrimidine-2,4-dione）结构相似；吡喃（pyran）是O-杂环药效团，具有多样药理潜力。基于此，研究人员将纳米技术用于优化合成，设计吡喃功能化嘧啶杂合体（pyran-functionalized pyrimidine hybrids），并结合密度泛函理论（DFT，Density Functional Theory）、分子对接、ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）和构效关系（SAR，structure–activity relationship）研究其抗Rhizoctonia solani潜力。

研究人员以银纳米粒子（Ag-NPs）为纳米催化剂，经亲核取代、环化、乙酰化、水解、缩合和Dimroth重排等多步反应合成吡喃-嘧啶杂合体1–7，并对优化合成化合物3、5、6开展抗真菌评价。体外实验使用从感染番茄根部分离的Rhizoctonia solani，测试1、10、20和50 ppm浓度。计算分析包括DFT、分子对接、分子动力学（MD，molecular dynamics）模拟、MM-GBSA（Molecular Mechanics/Generalized Born Surface Area）/PBSA（Poisson-Boltzmann Surface Area）自由能计算和ADMET预测。结果显示，所有测试化合物在50 ppm完全抑制真菌生长；化合物3、5、6在低浓度表现出强效抗真菌活性，其中3的EC₅₀为3.7 ppm，6为4.0 ppm，5为4.9 ppm；对接表明这些化合物多靶点结合并常优于氟康唑（fluconazole）；ADMET符合类药性规则但存在毒性风险。该研究首次在计算分析支持下比较吡喃功能化嘧啶对Rhizoctonia solani的保护作用，为开发高效、生态友好杀菌剂提供候选。

主要关键技术方法：采用Ag-NPs催化多步合成目标杂合体；体外抗真菌样本来源于Alexandria University植物病理学系从感染番茄根部分离的Rhizoctonia solani，于PDA培养基中测试1–50 ppm并用ANOVA和Tukey检验；DFT计算使用ORCA 6.1.1，B3LYP功能、def2-SVP基组和D3色散校正；分子对接使用AutoDock Vina，靶点来自RCSB，包括甾醇-14-α-脱甲基酶、琥珀酸脱氢酶、β-微管蛋白、几丁质合成酶、纤维素合成酶和细胞色素bc₁；MD使用GROMACS 2018、CHARMM36和CGenFF；自由能计算采用MM-GBSA/PBSA；ADMET使用ADMETLab 2.0。

结果与讨论：

银纳米粒子（Ag-NPs）性质评价。XRD分析显示Ag-NPs为面心立方结构，JCPDS卡号04–0783，2θ为38.29、44.55、64.82和77.44°，对应银(111)、(200)、(220)和(311)晶面，另有32.35、46.38、54.03和57.66°附加峰。FT-IR分析显示胺吸收带3347.85 cm^-1、C=O酰胺伸缩1636.17 cm^-1和指纹区548.38 cm^-1，表明纳米银表面反应性增强。SEM与EDX分析显示球形纳米粒和纳米簇，EDX约3.0 eV出现银峰。TEM与SAED分析显示粒径约15 nm，多数直径约5 nm，SAED证明结晶性。孔隙率表征（BJH模型）显示多数微孔小于40 nm，概率孔径约23 nm，高孔体积利于催化质量传输。

化学。Ag-NPs优化反应中，化合物4产率最高96.7%，反应1.15 h；化合物6产率96.1%；化合物5、7、3产率92.3–94.5%，时间4.45–6.00 h；产率经济（YE）值15.75–84.08优于传统方法3.58–18。Ag-NPs通过吸附底物、促进亲核攻击、稳定过渡态和降低活化能提高效率。化合物3经60% H₂SO₄水解得4，经AcOH缩合得5，与苯基异氰酸酯反应得6，与CS₂反应得7；Dimroth重排参与7的形成。

剂量-反应评估。所有五种合成化合物对Rhizoctonia solani高效，50 ppm时完全抑制生长（100%），与吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin）相同。1 ppm时差异明显，3处理中1 ppm使真菌生长增加约4.57%，其他处理抑制19–30%；10 ppm抑制率50.23–74.66%，优于氟康唑45%；3、5、6抑制率分别为74.66%、73.52%、68.04%。20 ppm抑制率69.41–100%，3完全抑制100%，5和6分别80.14%和95.89%。3在1 ppm出现hormesis（兴奋效应）。EC₅₀：3=3.7 ppm，6=4.0 ppm，5=4.9 ppm。3的IC₅₀显著低于氟康唑（p<0.01），4和5中等（p<0.05），7效果差，6显著改善（P<0.01），Pyraclostrobin最显著（p<0.001）。

计算分析。分子几何优化与DFT计算显示优化能量从3（?1728.262 Hartree）至7（?2562.598 Hartree）更负；HOMO–LUMO能隙从3/4的3.070 eV降至7的2.392 eV；电离势从5.564降至5.224 eV，电子亲和能从2.494升至2.832 eV，化学硬度从1.535降至1.196 eV，电亲性指数从5.289升至6.783 eV；7最软、最可极化、最强电亲体。优化几何从3至7共轭和平面性增加，ESP显示电荷分离增强。3具有最宽能隙、最高电离势、最大硬度和最低电亲性，却在低浓度最有效；7最窄能隙、最高软度和最强电亲性，活性最低，提示高电亲性和低硬度不利于抗真菌效力，适中硬度、较大能隙和较低电亲性更好预测低剂量高效。

分子对接。对甾醇-14-α-脱甲基酶，6结合能?10.30 kcal/mol，形成7个键，包括Arg381氢键；3为?10.20 kcal/mol，7个键，His480多接触氢键和Phe128 π-π堆积；5为?9.90 kcal/mol，8个键，3个氢键；氟康唑仅?7.80 kcal/mol且无氢键。对琥珀酸脱氢酶，3为?8.60 kcal/mol，8个键，4个氢键；6为?7.30 kcal/mol，9个键；5为?6.90 kcal/mol，6个键；氟康唑?8.70 kcal/mol，5个键。对β-微管蛋白，6为?7.10 kcal/mol，6个键；5为?6.50 kcal/mol，2个键；3为?6.40 kcal/mol，3个键；氟康唑?7.30 kcal/mol，5个键。对几丁质合成酶，6为?8.30 kcal/mol，8个键；3为?8.20 kcal/mol，7个键；5为?7.90 kcal/mol，9个键；氟康唑?7.60 kcal/mol，4个键。对纤维素合成酶，3和6均为?8.70 kcal/mol，分别6和7个键；5为?8.30 kcal/mol，6个键；氟康唑?7.10 kcal/mol，3个键。对细胞色素bc₁，3为?10.70 kcal/mol，11个键；5为?10.30 kcal/mol，11个键；6为?9.70 kcal/mol，9个键；均优于氟康唑。比较显示，测试化合物在CYP51优于tebuconazole，在bc₁优于azoxystrobin，对SDH与carboxin相当，对β-微管蛋白与carbendazim相似，并具有多靶点结合特征。

分子动力学模拟。甾醇-14-α-脱甲基酶-3复合物中，配体埋入结合位点，相互作用能近?60 kcal/mol，PCA显示平滑单态转变；MM-GBSA为?35.09 kcal/mol，MM-PBSA为+1.28 kcal/mol。琥珀酸脱氢酶-3复合物在100 ns内发生瞬态结构松弛后稳定，配体从初始位点移动到11.0–12.5 ?形成新平衡；MM-GBSA为?15.3 kcal/mol，MM-PBSA为?0.85 kcal/mol。β-微管蛋白-3复合物在100 ns内稳定折叠，配体与活性位点保持3.0–5.0 ?，但热力学验证受数据处理错误阻碍。纤维素合成酶-3复合物在50 ns内缓慢膨胀未达平衡，RMSD升至5.0 ?，Rg增加1.2 ?，配体稳定锚定约5.3 ?；MM-GBSA为?24.07 kcal/mol，MM-PBSA可忽略。总体上，MD和MM-GBSA支持对接预测，关键氢键大多保留。

ADMET预测。化合物3、6、5符合药物相似性规则（Lipinski、Pfizer和Golden Triangle）。氢键受体数分别为9、10、10，氢键供体数为5、6、6；TPSA为153.86、165.89、174.09 ?²，超过140 ?²，提示口服吸收可能较差。LogS为?3.58、?4.38、?4.12；LogP为1.54、2.70、1.51；LogD为1.84、2.78、1.70。P-gp抑制概率低，人肠吸收概率为零，Caco-2和MDCK渗透性负值。BBB渗透概率3为0.52、6为0.36、5为0；血浆蛋白结合率高（95.8%、98.56%、97.49%），游离分数低。CYP酶抑制或底物活性低，肝微粒体稳定性低，清除率3最高，半衰期1.12–1.48，BCF低。毒性预测中3和6致突变，5非致突变；三者非致肿瘤、非刺激，但均呈阳性生殖毒性；药物评分3最高0.29，5为0.22，6为0.18。

计算机毒性预测。3、5、6均预测肝毒性、神经毒性、肾毒性、呼吸毒性活跃，心脏毒性阴性；致癌性和临床毒性活跃，免疫毒性、致突变性、细胞毒性和营养毒性阴性；BBB渗透活跃，6最高；生态毒性3和5阴性，6边界阳性；Tox21核受体、应激通路和多数分子起始事件阴性；CYP代谢均阴性。主要关注点为肝、神经、肾、呼吸、致癌、BBB和临床毒性。

SAR分析。嘧啶氢键能力优化空间定向和药代动力学；氯芳基和氰基增强与真菌酶残基氢键；3在10 ppm抑制74.66%，1 ppm呈现hormesis；给电子–CH₃增加亲脂性和穿透性；6的苯基脲影响真菌代谢并提供双重供体-受体氢键，额外苯环增加亲脂性和π相互作用；5抑制80.14%，丁烯酸增加电子密度和极性，羧基改善氢键，不饱和增加膜穿透。3和5具有强供体-受体相互作用，5和6具有正软度、低硬度和高电亲性；3最软最反应。开放系统与吡喃环连接有利于4活性，因其体积小于融合嘧啶二硫7。

讨论部分总结：SAR表明氯芳基、氰基、甲基、苯基脲和羧基等取代影响抗真菌活性；DFT显示适中硬度、较大能隙和较低电亲性与低剂量高效相关；ADMET显示符合类药性但口服吸收差，毒性风险需优化。

结论翻译：本研究有效说明以化合物3为起点，利用纳米科学方法优化吡喃功能化嘧啶杂合体。结果表明，所研究杂合体对植物病原真菌Rhizoctonia solani表现出抗真菌活性，尤其在20和50 ppm浓度。这些发现提示所有测试化合物具有强抗真菌性质，其中3、6和5分别能够高度或完全抑制真菌生长。DFT计算通过阐明电子结构和全局反应性描述符，支持化合物的热力学稳定性，这对分子识别过程重要。可能需要进一步研究其作用方式及潜在应用。化合物3和6成为高效、多靶点抗Rhizoctonia solani抗真菌剂，通过与关键真菌酶形成高度稳定且热力学有利的复合物，显著优于参考药物氟康唑。此外，环境毒性较低。化合物5作为更安全的非致突变替代物。这些结果证明吡喃功能化嘧啶基化合物作为强效抗真菌剂的潜力，并展示纳米催化合成方法在纳米科学中的机会。研究人员未来工作将聚焦于扩展至其他新型杂合体，靶向效力和选择性，并基于鼓舞人心的体外效力和SAR趋势开展体内研究，辅以相关靶点计算研究，为下一代生态友好可行候选物铺平道路。