《Scientific Reports》：High-throughput screen identifies metabolite regulators of endothelial function
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内皮细胞（endothelial cells，ECs）排列于血管内壁，调控器官稳态，其功能障碍是心血管疾病发生的核心。代谢物是EC健康和功能的关键调控因子，然而仅有限数量的影响EC的代谢物被鉴定。在此，研究人员对884种存在于人体生物流体中的代谢物和常用药物进
内皮细胞（endothelial cells，ECs）排列于血管内壁，调控器官稳态，其功能障碍是心血管疾病发生的核心。代谢物是EC健康和功能的关键调控因子，然而仅有限数量的影响EC的代谢物被鉴定。在此，研究人员对884种存在于人体生物流体中的代谢物和常用药物进行了高通量筛选，以系统鉴定影响原代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein ECs，HUVECs）屏障功能的化合物。研究筛选出7种在不引起细胞死亡的情况下破坏血管屏障功能的代谢物。这些代谢物包括(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate）、(±)-3-甲基-2-氧代戊酸（(±)-3-methyl-2-oxovaleric acid）、牛磺胆酸（taurocholic acid）、杨梅素（myricetin）、美洛昔康（meloxicam）、橙皮素（hesperetin）和trans-3-indoleacrylic acid。这些代谢物对HUVECs、冠状动脉ECs（coronary artery ECs）和肺ECs（pulmonary ECs）产生差异性效应。转录谱分析显示，7种代谢物各自在ECs中触发不同的转录反应，提示触发EC屏障破坏的机制不同。值得注意的是，trans-3-indoleacrylic acid使血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）连接失调并增加EC出芽，提示其在血管生成（angiogenesis）中可能发挥作用。总之，这些结果为代谢物-内皮相互作用提供了筛选资源，并鉴定了调控内皮功能的候选循环代谢物。
论文解读：高通量代谢物筛选鉴定内皮功能调控因子
研究背景：内皮细胞（endothelial cells，ECs）衬于血管内层，作为血液与器官实质之间的半透性屏障，动态调控血管稳态。ECs功能障碍参与痴呆、冠状动脉疾病、卒中、非酒精性脂肪肝和慢性心力衰竭等疾病。屏障完整性破坏常由炎症或代谢信号触发，导致黏附连接和紧密连接复合体解体及细胞间裂隙形成，血管渗漏是动脉粥样硬化、肺水肿和阿尔茨海默病等疾病的标志。代谢应激是内皮功能障碍和心血管疾病的重要驱动因素。人类队列代谢组学显示，循环代谢物可预测心血管疾病风险，并可作为血管功能障碍的活性贡献者；例如高烟酸水平增加EC炎症并与心血管事件风险增加相关，肠道微生物来源的氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide，TMAO）促进动脉粥样硬化，咪唑丙酸通过激活炎症通路促进动脉粥样硬化形成。然而，尚无无偏倚、系统性的循环代谢物筛选来鉴定影响EC功能的化合物。因此，研究人员假设人生物流体中的部分循环代谢物和化合物可直接扰乱内皮屏障完整性，并开展884种代谢物的高通量筛选。
研究人员开展了什么研究：研究人员使用MetaSci代谢物库，该库含1100种此前在人生物流体中发现的化合物；其中884种可溶于适合细胞培养的溶剂并用于筛选。以200 μM作为标准化初筛浓度，在原发性人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中用电细胞-基底阻抗传感（electric cell-substrate impedance sensing，ECIS）实时量化屏障功能48 h，计算曲线下面积（area under the curve，AUC）。经过初筛、二次筛选、活力排除和独立验证，研究人员筛选出7种在不引起细胞死亡的情况下持续破坏EC屏障完整性的代谢物：(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）、杨梅素（myricetin）、橙皮素（hesperetin）、(±)-3-甲基-2-氧代戊酸（(±)-3-methyl-2-oxovaleric acid，KMV）、美洛昔康（meloxicam）、牛磺胆酸（taurocholic acid，TCA）和trans-3-indoleacrylic acid（IDA）。这些代谢物在HUVECs、冠状动脉ECs和肺ECs中产生差异效应；转录谱显示各自触发不同转录反应，提示不同机制。特别地，IDA使VE-钙黏蛋白（VE-cadherin）连接失调并增加EC出芽。该研究提供了代谢物-内皮相互作用的筛选资源，并鉴定出调控内皮功能的候选循环代谢物。
关键方法：研究采用MetaSci人生物流体代谢物库，1100种化合物中884种可溶并进入筛选，无患者队列来源。以200 μM在HUVECs中进行ECIS实时屏障检测，并以AUC筛选；二次筛选后结合碘化丙啶染色和流式细胞术评估细胞活力。对7种入选代谢物处理HUVECs后进行bulk RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq），以log
2倍数变化阈值>0.5或
研究结果：
1. 高通量代谢物筛选鉴定破坏EC屏障功能的化合物：初筛884种代谢物，选AUC低于?20或高于+20者，获得151种候选；二次筛选后33种持续表现强屏障破坏活性，定义为AUC低于?15；结合细胞活力和生物学意义，最终7种入选。通过ECIS和AUC计算得出结论。
2. 多样代谢物在不引起细胞死亡的情况下影响EC屏障功能：用不同批次HUVECs进行三次独立ECIS实验，7种代谢物均显著降低HUVEC屏障电阻并降低AUC；碘化丙啶染色和流式细胞术显示均未降低细胞活力，表明屏障丧失非继发于细胞毒性。这些代谢物涵盖植物黄酮、胆汁酸、支链氨基酸中间体、抗炎药和肠道微生物来源吲哚。
3. 代谢物对内皮屏障完整性的影响在不同内皮细胞亚型间存在差异：在人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells，HCAECs）和人肺微血管内皮细胞（human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMECs）中检测，EGCG、KMV和橙皮素在两种细胞中均显著破坏屏障；美洛昔康仅损害HCAECs；IDA和TCA不影响HCAECs但损害HPMECs；杨梅素对两者均无影响。得出结论：代谢物可引发EC亚型差异反应。
4. 代谢物处理在ECs中触发多样转录变化：对7种代谢物处理的HUVECs进行RNA-seq，发现均诱导转录变化但幅度不同，EGCG和橙皮素最广泛；各代谢物之间整体相关性低。共同特征包括PTGS2上调和GJA4下调，还涉及LINC01235、LINC02669和NORAD等非编码RNA。共同上调通路富集于HIF-1和TNF信号，下调通路富集于黏着斑和肌动蛋白细胞骨架调控。连接蛋白、炎症、VEGF信号和氧化应激相关基因呈现代谢物特异性变化。得出结论：屏障破坏通过多样且非重叠机制。
5. Trans-3-Indoleacrylic acid (IDA)增强ECs出芽形成：聚焦IDA、TCA和杨梅素。免疫染色显示IDA而非TCA或杨梅素显著增加VE-cadherin裂隙。浓度梯度ECIS显示IDA在200 μM显著破坏屏障，较低浓度无显著效应；Transwell实验显示IDA处理24 h增加3 kDa示踪剂通透性，4 h无增加。球体出芽实验中IDA增加出芽数量和长度，划痕迁移实验无变化，THP-1单核细胞黏附实验无增强。IDA是Peptostreptococcus spp合成的色氨酸衍生肠道代谢物。结论：IDA以浓度依赖方式破坏屏障，影响VE-cadherin连接和促出芽，而不影响迁移和单核细胞黏附。
讨论部分总结：讨论指出代谢风险因素与心血管疾病关联推动鉴定直接贡献血管功能障碍的代谢物；已知支链氨基酸、饮食代谢物、胆汁酸和肠道微生物代谢物等。本研究系统汇编884种代谢物对EC屏障完整性的影响。七种代谢物在EC亚型间差异效应与器官型特化一致。转录反应不重叠，PTGS2在七种中六种上调，COX-2衍生的前列腺素信号可能是共同机制之一；HIF-1/TNF上调和黏着斑/细胞骨架下调涉及屏障稳定性。IDA作为芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）配体，诱导ALDH1A3、CYP1A1和CYP1B1等经典靶点，可能参与VE-cadherin破坏和出芽。局限包括体内稳定性、生物利用度、剂量依赖、200 μM超过部分代谢物循环血清浓度、需正交通透性实验、紧密连接蛋白分析和体内研究。
研究结论翻译：总之，通过高通量代谢物筛选，研究人员鉴定出破坏内皮屏障完整性的循环代谢物。7种入选代谢物诱导独特转录变化，靶向不同通路并引发亚型特异性EC反应。其中，肠道微生物群来源的IDA因其对EC屏障完整性和出芽的影响而成为特别有趣的代谢物。总之，研究人员的工作提供了涵盖诱导EC功能障碍的代谢物的资源，并建立了未来机制研究中系统探索代谢物-内皮相互作用的框架。
