《Biochemical Pharmacology》：A
Vibrio-susceptibility class of antimicrobial peptide Ajapocin via membranolytic pattern to combat “non-cholera” pathogens
in vivo infection models
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本研究发现海参加源抗菌肽Ajapocin，其MIC值（6-12 μM）与临床药物Polymyxin B相当，能有效抑制V. parahaemolyticus和V. vulnificus，并促进小鼠伤口愈合，同时证实其安全性。机制研究显示该肽通过膜损伤作用增强渗透性。
王晓飞|洪晓|刘Wanting|徐玉军|陈若诗|陈芳仪|王克健|王Luxi
中国福建省厦门市厦门大学海洋与地球科学学院海洋环境科学国家重点实验室
摘要
致病性的“非霍乱”弧菌（包括副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）和创伤弧菌（V. vulnificus））经常通过引发传染病对水产养殖安全和公共卫生构成严重威胁。在本研究中，我们发现了一种名为Ajapocin的海洋来源抗菌肽（AMP），该肽是通过序列优化策略鉴定出来的。Ajapocin对副溶血性弧菌和创伤弧菌表现出强烈的抑制作用，其最小抑制浓度（MIC）为6–12 μM，与临床使用的多粘菌素B（PMB）相当。在斑马鱼弧菌感染模型中，单次给予1 mg/mL的Ajapocin即显示出治疗效果；在创伤弧菌感染的小鼠皮肤伤口模型中，多次给药可减少细菌数量并加速伤口愈合。在浓度高达32 μM的情况下，Ajapocin对ZF4细胞和HaCaT细胞无细胞毒性。值得注意的是，经过一周的腹腔注射后，Ajapocin未引起肝脏或肾脏的累积毒性，这一点通过组织病理学分析和化学检测得到证实。从机制上看，Ajapocin通过与膜相互作用来增强膜通透性、诱导膜去极化，最终导致膜损伤和细菌功能障碍。综上所述，Ajapocin是一种有前景的抗菌剂，适用于水产养殖和临床环境中对抗弧菌感染。
引言
弧菌属细菌是源自水生和海洋环境的革兰氏阴性菌[1,2]。其中，副溶血性弧菌和创伤弧菌作为非霍乱病原体，特别重要，因为它们会引起水生生物的严重感染，并被认为是主要的环境人类病原体[3, [4], [5]]。除了其机会性致病特性外，流行病学调查显示大约12%的弧菌种类能够引起人类感染[1]。令人担忧的是，近年来耐抗生素的弧菌菌株的流行率显著增加，导致多种弧菌病和临床表现[6,7]。如果没有有效的治疗，弧菌感染可能迅速发展为危及生命的状况。因此，迫切需要有效的抗菌剂来消灭这些高毒力的病原体，这突显了开发针对弧菌感染的实用和针对性策略的重要性。
抗菌肽（AMPs）在多种物种中存在，对抵抗入侵的致病细菌起着关键作用[8,9]。这些肽具有多样的作用机制，使其成为对抗耐抗生素弧菌菌株的有希望的候选物质[10,11]。然而，弧菌属细菌在嗜盐环境中能够生存，这通常会降低许多传统AMP在高盐环境中的效力[12,13]。为了克服这一限制，来自海洋无脊椎动物的AMPs受到了关注[14, [15], [16], [17], [18], [19]]，因为它们天然适应盐分环境，并可能在这种环境中保持强大的活性[17,[19], [20], [21]]。此外，海洋无脊椎动物产生的AMPs通常具有阳离子和疏水性特性[19]，这对于有效靶向微生物膜的关键成分至关重要[19,22]。因此，我们专注于某些具有先天免疫系统的海洋物种，因为我们认为从这些生物中提取的肽可能具有更强的抗菌活性或更高的耐盐能力[14]。尽管人们对弧菌感染的认识日益增加，但关于抗弧菌AMPs的研究仍然有限。因此，鉴定和表征具有强杀菌活性的耐盐AMPs对于推进针对弧菌感染的治疗策略具有重要意义。
为了发现更有效的抗弧菌剂，我们基于基因组数据[23,24]，以海参（Apostichopus japonicus）为研究对象开展了筛选策略。我们的方法结合了结构-活性导向的设计，并考虑了AMPs所需的物理化学性质，如适当的肽长度、适度的正电荷和平衡的疏水性[8]。此外，我们还通过挖掘已报道的AMP数据库[25,26]进行了AMP优化。这一过程导致我们首次鉴定出一种未充分利用的先导肽——Ajapocin。其物理和化学参数与已知的AMPs高度相似，预测分析表明Ajapocin具有α-螺旋结构。接下来，我们进行了两项实验来验证其强大的抗弧菌活性和快速杀菌效率。重要的是，我们开发了一种前药策略来提高Ajapocin的体内效果，这通过斑马鱼感染模型和小鼠伤口感染模型进行了评估。此外，我们详细讨论了Ajapocin的作用机制，包括其对膜破坏的作用，这涉及到增强膜通透性和诱导膜去极化。通过细胞模型确认了Ajapocin的体外安全性，并通过一周的多次给药评估了其体内的累积毒性。总之，我们的研究提出了一种基于AMP的策略，用于应对弧菌感染。
章节片段
肽合成与抗生素制备
肽是通过标准固相肽合成（SPPS）方法使用rink酰胺AM树脂合成的。该过程包括依次进行氨基酸偶联反应，然后用三氟乙酸从树脂上切割肽。获得原始肽后，所有肽都经过C端酰胺化修饰处理。通过质谱（MS）和高性能液相色谱（HPLC）联合检测，肽的纯度达到95%以上
Ajapocin的体外抗菌活性
为了对抗由副溶血性弧菌和创伤弧菌引起的感染，我们鉴定出一种新型AMP——Ajapocin，并进一步确定了其明确的骨架结构、有益的物理化学性质和典型的α-螺旋特征（图1A-B和表1）。为了证明其体外杀菌效果，我们使用抑制圈法测试了Ajapocin对弧菌的抗菌活性。如图1C和表2所示，在1 mg/mL浓度下，Ajapocin表现出强烈的杀菌效果
讨论
弧菌属细菌在水产养殖环境和公共卫生中被归类为I类致病菌[1,48,49]。其中，副溶血性弧菌和创伤弧菌是典型的非霍乱病原体，会在易感个体中引起多种感染和严重并发症[2,5,50]。尽管疾病控制与预防中心（CDC）最近对弧菌感染发出了警告[51]，但人们对这些细菌的致病性和毒力的了解仍然有限，且缺乏系统的监测
CRediT作者贡献声明
王晓飞：撰写初稿、软件开发、方法学设计、研究实施、资金申请。洪晓：撰写初稿、监督工作、软件开发、方法学设计。刘Wanting：软件开发、方法学设计、数据分析。徐玉军：软件开发、方法学设计。陈若诗：软件开发、方法学设计。陈芳仪：结果验证、软件应用、资金申请、数据分析。王克健：撰写修订稿、数据可视化、结果验证、资源协调、资金申请、数据分析、数据整理
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究工作。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号U1805233/32200620）、福建省海洋创新中心（项目编号25FV0CLZ09）、福建省海洋与渔业局（项目编号FJHY-YYKJ-2024-2-3）以及厦门市海洋发展局（项目编号22CZP002HJ08）的财政支持。同时，我们也感谢Hui Peng和Zhiyong Lin在技术指导方面的帮助。
