无细胞及含细胞的空心导管的流变学特性及共轴挤出不纯κ-卡拉胶水凝胶与金-κ-卡拉胶纳米复合水凝胶的行为研究

《Materials Advances》：Rheology and coaxial extrusion of acellular and cell-laden hollow conduits of pristine kappa carrageenan and gold–kappa carrageenan nanocomposite hydrogels

　　本研究探讨了使用κ-卡拉胶（κCG）水凝胶通过多材料挤出与同轴喷嘴制造载有细胞的中空导管的方法。我们使用了自制的装置，配备两个注射泵，将离子交联的κCG和金-κCG纳米复合体（κCG–AuNP）水凝胶挤出到交联浴中，用以形成导管外壳和牺牲性核心。我们测试了不同的κCG组成和流速，发现内层纤维直径在625到700微米之间，外层直径在1000到1030微米之间。灌注实验表明，以较高流速挤出的2%（重量/体积）κCG–AuNP水凝胶保持了完整性，使得在较长的纤维中实现均匀灌注。流变学分析表明，金纳米颗粒（AuNPs）降低了水凝胶的储能模量和粘度，而交联浴在交联后提高了储能模量。2%（重量/体积）κCG–AuNP水凝胶在高流速挤出过程中表现出延迟断裂的特性，有利于灌注过程中的操作。重要的是，添加A549细胞并未影响其流变性能或 pinch-off 动力学，且在导管壁内的细胞存活率超过60%。因此，2%（重量/体积）κCG–AuNP水凝胶显示出快速制造用于体外模拟管状生物结构的中空导管的潜力。

1. 引言
组织工程的主要目标是制造出能够再现天然组织复杂微观结构的支架，以使其具备功能性。这包括设计能够像生理组织一样输送血液、氧气和营养物质等流体的血管人工组织。同轴挤出是一种一步策略，通过同轴喷嘴同时挤出两种不同的生物聚合物来制造中空或多 materials 的管状结构。挤出可以是气动式的，也可以是通过活塞来实现的。活塞挤出通常使用注射泵来完成。制造人工血管导管的一种常用方法是多材料挤出一种可交联的水凝胶以及可以通过物理方法溶解或去除的牺牲性核心。最近，人们对使用聚氧乙烯醇 F-127（Pluronic F-127）作为同轴挤出中的牺牲性核心产生了浓厚的兴趣。由于其出色的可印刷性、剪切稀化行为以及在4°C时的溶液特性，聚氧乙烯醇 F-127非常适合用于制造内腔直径可调的中空通道。这可以通过调整外壳生物聚合物墨水的组成和它们的流速来实现。

现有关于同轴挤出的文献主要集中在使用海藻酸盐作为制造中空管的首选生物材料上，因为海藻酸盐具有良好的机械性能，并且可以使用CaCl2快速进行离子交联。κ-卡拉胶（κCG）与海藻酸盐类似，是一种由交替的半乳糖和3,6-脱水半乳糖单元组成的阴离子多糖。最近，由于其生物相容性、可生物降解性和热响应性凝胶化能力，κCG被重新用于生物医学领域，被改造成水凝胶、纤维、支架等。我们的团队以及Marques及其同事分别研究过κCG在3D打印和生物打印中的应用，他们展示了κCG在3D打印支架中的高细胞存活率和重组能力。我们团队的先前工作还展示了κCG水凝胶颗粒和乳液凝胶的制造。然而，关于基于κCG的中空可灌注导管的制造信息仍然较少。因此，基于现有的关于κCG和海藻酸盐的文献，我们假设由于κCG也是一种类似于海藻酸盐的负电荷生物聚合物，能够与正电荷离子发生交联，因此它也应该能够在与氯化钾（KCl）交联后形成自支撑的中空管。尽管κCG也可以通过Ca2+进行离子交联，但不同的离子会在κCG中引发不同的凝胶化行为。已知K+离子形成的κCG凝胶比Na+或Ca2+离子形成的凝胶更坚固。此外，Lim及其同事报告称，在使用K+离子通过同轴喷嘴挤出甲基化κCG水凝胶制造载有细胞的支架时，对NIH 3T3细胞没有毒性。这一先例确立了KCl作为制造载有细胞的空心纤维的安全离子交联剂。然而，需要注意的是，海藻酸盐和κCG之间的离子交联和凝胶化机制是不同的。κCG水凝胶在反离子存在下通过螺旋聚集驱动的离子相互作用发生交联。单价阳离子如K+中和其聚合物链上的负电荷硫酸基团，导致螺旋二级结构的形成，从而引发凝胶化。相比之下，海藻酸盐与Ca2+发生离子相互作用，形成类似蛋盒的结构，最终导致二聚体的形成。这些二聚体进一步聚合，从而引发凝胶化。需要强调的是，这项研究的主要目的不是证明κCG水凝胶优于海藻酸盐，而是研究这种相对较少被探索的生物聚合物是否可以优化为适合同轴挤出的材料，能够在挤出过程中及之后支持活细胞。此外，作为硫酸化多糖的κCG可以在纳米颗粒形成过程中作为聚电解质，为纳米颗粒在其柔软基质内提供稳定性。先前的报告表明，κCG的悬挂羟基可以作为金属纳米颗粒的封端和稳定剂。聚合物基质中的金纳米颗粒（AuNPs）赋予额外的生物和机械性能。根据它们的形状和大小，AuNPs可以促进细胞在支架中的粘附，诱导细胞分化和成熟，通过赋予支架系统电导性来改善细胞-细胞间的耦合，并调节支架的机械性能。AuNPs在水凝胶中的存在可以增加基于软天然聚合物的基质的硬度，同时改善剪切稀化行为，使这些纳米复合水凝胶非常适合最佳的细胞附着、粘附和生物打印。还有许多关于原位合成的金-壳聚糖纳米复合水凝胶作为生物医学应用候选材料的报道，包括组织工程和药物输送。

κCG还被用作AuNPs的还原和稳定剂，例如在降解偶氮染料中的应用。关于金-κCG纳米复合材料的研究有限，包括它们的生物医学应用，如抗肿瘤活性和伤口愈合特性。值得注意的是，有一项研究利用了低浓度的κCG（0.5 mg/mL到0.08 mg/mL）来合成AuNPs，但未能形成水凝胶。该研究发现，κCG中的AuNPs在A549肺癌细胞系中未引起显著的细胞毒性。AuNPs还可以淬灭活性氧（ROS），表现出抗氧化行为。因此，尚未解决在含有较高浓度κCG的真实水凝胶基质中形成原位AuNPs及其对细胞存活率的影响，而这种水凝胶适用于挤出和形成自支撑的中空管。对含有原位合成的AuNPs的κCG和豆胶复合水凝胶的流变学分析显示，随着添加到κCG中的HAuCl4浓度的增加，粘度降低，从而赋予了更好的剪切稀化性能。然而，对于探索金-κCG纳米复合水凝胶的生物墨水可印刷性、流变特性、载有细胞的3D打印结构和血管结构方面的研究仍然有限。我们设想，κCG水凝胶中的AuNPs将调节其流变行为，在3D微环境中提高细胞存活率，并可能改善中空导管的生物性能。在同轴挤出过程中，材料主要在喷嘴内经历剪切流。一旦材料离开喷嘴，在沉积到构建表面时，它转变为拉伸流。因此，了解复杂流体的拉伸性能对于加工操作（如喷射、纺丝和涂层）至关重要，这些操作中拉伸变形模式占主导地位，同时也对于分析用于挤出和打印的生物墨水非常重要。材料在拉伸流中的行为通常与剪切流中的行为有很大不同。像Capillary Breakup Extensional Rheometer（CaBER）这样的设备通过观察流体丝的变薄和断裂提供了宝贵的见解。在聚合物溶液中，拉伸流可以导致柔性大分子解旋，从而导致拉伸变薄或增稠。这种现象显著改变了流体的流动响应。分子量、结构、温度和浓度等因素的微小变化会影响样品在拉伸下的反应，使得拉伸流变学特性成为质量控制的宝贵工具。虽然常用的方法如CaBER很常见，但另一种技术，如滴落到基底上的方法，也可以提供拉伸特性分析。这种方法涉及将样品从喷嘴缓慢滴到基底表面上形成液体桥梁，最终由于毛细力导致桥梁断裂。使用高速相机记录这一过程可以提供关于流体拉伸性能的宝贵数据，为流变学分析提供了一种实用且信息丰富的方法。我们实验室之前的工作使用1%（重量/体积）κCG与25 mM KCl交联，成功打印了复杂的形状，并在24小时后证明了A549肺癌上皮细胞的优异生物相容性（98%）。Sasikumar C.及其团队使用肺上皮细胞（如L-132和A549）制备了用于3D生物打印的粘蛋白和透明质酸生物墨水，旨在制造打印的肺组织。值得注意的是，含有原位合成的平均粒径为14.3 ± 2.1 nm的AuNPs的κCG基水凝胶在A549细胞上未表现出细胞毒性。A549细胞也被广泛用于3D生物打印，以制造载有细胞的孔状网格支架作为肺癌模型。然而，迄今为止，还没有报告使用A549细胞通过同轴生物打印制造中空管状结构作为潜在的肺癌模型。因此，在这项研究中，我们展示了使用无细胞的金-κCG（κCG–AuNP）纳米复合材料、原始κCG以及封装在κCG–AuNP和κCG水凝胶中的A549肺癌癌细胞制造中空管状导管的方法。这是通过同轴挤出后，在挤出浴中进行离子交联来实现的，使用了聚氧乙烯醇 F-127作为牺牲性核心。我们通过显微成像和灌注实验监测了鞘层κCG和κCG–AuNP墨水流速对通道直径的变化以及中空导管的均匀形成。流变学研究和pinch-off 动力学结果表明，κCG的重量百分比（wt%）和AuNPs的存在显著影响了墨水的储能模量、粘度和纤维断裂时间。此外，我们还研究了在κCG和κCG–AuNP水凝胶中以每毫升2 × 10^6个细胞的浓度封装肺癌癌细胞对其流变性能和pinch-off 动力学的影响。我们的发现表明，AuNPs的存在并未给封装的肺癌癌细胞带来额外的毒性，使得成功形成了生物相容的、载有细胞的κCG–AuNP水凝胶中空导管。

2. 材料与方法
2.1. 样品制备
为了制备原始的κCG交联水凝胶，将150毫克、200毫克和225毫克的κ-卡拉胶粉末（Sigma-Aldrich）与10毫升10 mM氯化钾（KCl）混合。这产生了不同κCG浓度的水凝胶：15毫克/毫升（1.5% w/v）、20毫克/毫升（2% w/v）和22.5毫克/毫升（2.25% w/v）。混合物在70°C的水浴中以800转/分钟的速度搅拌2小时，直到κCG粉末完全溶解。原始κCG墨水在整篇文献中将被称为1.5κCG、2κCG和2.25κCG。为了在κCG水凝胶中原位合成AuNPs，将150毫克、200毫克和225毫克的κCG粉末溶解在10毫升10 mM氯化钾（KCl）溶液中。这产生了不同κCG浓度的水凝胶：15毫克/毫升（1.5% w/v）、20毫克/毫升（2% w/v）和22.5毫克/毫升（2.25% w/v）。水混合物在水浴中加热到70°C，并持续以800转/分钟的速度搅拌。一旦水浴达到70°C，向混合物中加入1毫升1.52 mM的三氯化金（HAuCl4·3H2O）溶液（Sigma-Aldrich），然后继续搅拌24小时。从这一点开始，原位合成的金-κCG纳米复合墨水在整篇文献中将被称为1.5κCG–AuNP、2κCG–AuNP和2.25κCG–AuNP。

2.2. 在κCG水凝胶中原位合成的AuNPs的表征
在含有不同重量百分比κCG的水凝胶基质中合成AuNPs的情况，通过24小时反应后的紫外-可见光谱法得到了确认。AuNPs的尺寸是通过原子力显微镜（AFM）来评估的。样品按照之前的方法制备，并稀释至1 mg/mL后，然后滴涂到云母片上。制备好的样品在干燥器中干燥24小时，随后使用Bruker NanoWizard Sense进行AFM成像，采用敲击模式。使用Nanoscope分析软件处理和分析获得的图像。AuNPs的流体动力学尺寸也是通过动态光散射（DLS）使用Brookhaven NanoBrook仪器来确定的。与AFM类似，样品首先在过滤的去离子水中稀释至1 mg/mL后进行测量。κCG–AuNP和κCG水凝胶中的官能团进一步通过傅里叶变换红外（FTIR）光谱使用Bruker Invenio-S FTIR光谱仪进行表征。ATR探针直接压在放置在晶体台上的冻干样品上，并在400–4000 cm?1的光谱范围内扫描。

2.3. 同轴挤出

使用Rame-Hart Instrument Co.（美国）提供的预组装同轴喷嘴，该喷嘴由内径为584 μm（20G）的内针和外径为1190 μm（16G）的外针组成。这个喷嘴连接到两个5 mL的注射器：一个含有30%（w/v）的Pluronic F-127溶液，另一个含有原始的κCG或κCG–AuNPs，如图1所示。样品在高温下溶解在注射器筒中。随后进行10–12分钟的孵育时间，在此期间通过温度探头连续监测水凝胶的温度，直到温度降至37°C。只有在水凝胶温度达到37°C后，才开始挤出过程。图1展示了同轴挤出装置，使用Biorender.com创建。Pluronic F-127通过内针以恒定流量1 mL/min挤出，形成纤维的核心。同时，原始的κCG或κCG–AuNP水凝胶通过外针以不同的流量0.5–5 mL/min挤出，即在达到37°C后立即开始。挤出的纤维直接沉积在含有100 mM KCl溶液的培养皿中，该溶液用作挤出后的交联浴（见补充电影）。喷嘴位于交联浴上方4–5 mm处。将纤维浸入交联浴中，在4°C下孵育半小时以去除Pluronic F-127的牺牲核心。孵育后，丢弃100 mM KCl溶液，并使用立体显微镜对空心纤维的截面进行成像。空心通道的圆度指数通过以下公式确定：

(1)

其中c是圆度指数，A是截面面积，L是空心通道的周长。完美的圆形的圆度指数为1；拉长的形状的圆度指数为0.39。

2.4. 灌流实验

通过灌流实验评估了同轴挤出后空心通道的制备质量。使用配备23G喷嘴（内径=330 μm）或27G喷嘴（内径=200 μm）的5 mL注射器，将绿色食用染料注入纤维的空心通道中。

2.5. 流变学

使用应力控制模块化紧凑流变仪（Anton Paar MCR302）在制备后24小时评估形成空心纤维壳的水凝胶的流变性质。所有关于原始κCG和κCG–AuNP水凝胶的流变测量都是在37°C的挤出温度下进行的。样品在37°C下平衡10分钟，然后进行任何流变测试。当天还对 bath-crosslinked 原始κCG和κCG–AuNP水凝胶进行了流变表征。这包括铸造和冲压出厚度为2 mm、直径为25 mm的水凝胶圆盘，然后在4°C的100 mM KCl浴中孵育半小时。为了确定κCG和κCG–AuNP水凝胶的线性粘弹性区域（LVR），进行了大振幅振荡应变扫描，应变范围从0.01%到1200%，角频率为6.28 rad s?1。在LVR区域内，通过小振幅振荡频率扫描测量了动态粘弹性模量，范围从0到100 rad s?1，应变固定。此外，使用以下公式从频率扫描中确定了相位角：

(2)

其中G″是损耗模量，G′是储能模量。通过将剪切率对数增加从0.01到100 s?1来获得水凝胶的流动曲线，以分析它们的流动行为。使用幂律模型来表征水凝胶的剪切变稀性质。通过将剪切率-粘度曲线拟合到以下幂律方程来计算n和K的值：

η = Kγ·n?1

(3)

其中η是粘度，γ·是剪切率。实验使用直径为50 mm、间隙为0.5 mm的平行板几何形状进行。 bath-crosslinked 水凝胶圆盘使用直径为25 mm、间隙为2 mm的平行板进行测试。

2.6. 机械表征

使用万能试验机（UTM）在无约束压缩条件下量化了形成空心纤维壳的水凝胶的机械性质。原始κ-carrageenan（κCG）和κCG–AuNP水凝胶在制备状态和通过浸入100 mM KCl浴中离子交联30分钟后进行了测试。圆柱形样品（每种条件3个；高度约为16 mm，直径约为15 mm）放置在70 mm的压缩板上，并使用平行70 mm的上板以1 mm min?1的交叉头速度压缩直至失效（见补充电影）。从记录的力-位移数据计算工程应力-应变曲线，并从应力-应变响应的初始线性区域的斜率确定压缩模量。

2.7. 纤维断裂动态实验

在实验室中构建了一个滴落到基底上的流变学装置，用于测量37°C下κCG和κCG–AuNP水凝胶的断裂动态和延展性质。将玻璃滑动片水平放置，位于垂直注射器下方10 mm处。注射器连接到注射泵，以3 mL min?1和5 mL min?1的流速挤出样品，与同轴挤出期间使用的流速一致，直到样品接触基底并形成水凝胶纤维。然后关闭泵送。一个LED光源和一个以每秒5000帧的速度运行的高速摄像机记录了纤维直径（D(t)）随时间的变细过程。这些视频使用自定义的MATLAB代码分析，以跟踪每一帧的纤维直径（D(t)）的变化。进行了多达10次试验以确保重复性，并使用纤维直径（D(t)）的平均衰减曲线进行进一步分析。κCG和κCG–AuNP水凝胶的表面张力（σ）测量对于分析延展参数至关重要。这些测量使用了Adrian Daerr提出的方法，因为其他方法，如张力计测量，对于水凝胶来说存在挑战并且不可靠。

复合物流的流变学表征通常需要确定一个称为特征松弛时间（λ）的本构参数。这个参数量化了样品中存在的弹性能量。方程（4）描述了D(t)的指数衰减，其中λ是特征延展松弛时间，t是观察时间，Do是注射器筒的Luer锁的内径（1880 μm）。当在延展模式下施加应力时，粘度系数称为延展粘度（ηe）。延展应变率是根据纤维直径及其随时间的变化率得出的，如方程（6）和（7）所示。

2.8. 细胞培养和细胞负载的同轴挤出

肺癌细胞（A549）在37°C和5% CO2的Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）（Gibco）中培养，补充了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素。对于细胞负载的同轴挤出，在无菌条件下使用相同的装置。细胞用0.25% Trypsin-EDTA（Gibco）进行消化，并以每mL 2 × 10^6个细胞的浓度悬浮在原始κCG和κCG–AuNP水凝胶中。细胞负载的κCG和κCG–AuNP水凝胶的流速保持在5 mL min?1，并将它们沉积在含有100 mM KCl交联浴的共聚焦培养皿中。在4°C的100 mM KCl中交联后，纤维用1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，并在37°C的完全DMEM培养基中孵育24小时。挤出过程在层流柜中进行，壳材料和牺牲核心水凝胶样品都使用高压灭菌的去离子水（DI）在无菌条件下制备。此外，在进行细胞负载的同轴挤出实验之前，同轴喷嘴也进行了半小时的高压灭菌。

2.9. 细胞活力测定

将细胞负载的空心纤维在37°C的细胞培养基中孵育24小时后，进行了活死细胞测定以评估播种的A549细胞的活力。首先用1× PBS缓冲液洗涤纤维，然后轻轻去除培养基。Calcein AM（2.25 μM）和propidium iodide（3.75 μM）在无血清培养基中稀释以制备染色溶液。接下来，将1 mL的染色溶液轻轻加入到含有空心纤维的共聚焦培养皿中，并在37°C下孵育15分钟。使用Leica TCS SP8共聚焦显微镜在10×放大倍数下捕获三张代表性图像。细胞活力通过以下公式计算：

3. 结果与讨论

3.1. AuNPs的表征

使用分光光度分析研究了AuNPs在κCG水凝胶聚合物基质中的成功合成，如图2(a)所示。观察到的最大吸收值约为532 nm、534 nm和531 nm，分别对应1.5κCG–AuNP、2κCG–AuNP和2.25κCG–AuNP，证实了Au3+被κCG链的羟基还原为Au0。此外，在AuNPs形成过程中，从透明的κCG溶液观察到明显的颜色变化，变为粉红色，这归因于表面等离子体共振（SPR）现象。图2显示：
(a) 在70°C的水浴中合成24小时的κCG不同组合物中的AuNPs的紫外-可见光谱；(b)、(c) 和 (d) 分别是1.5κCG–AuNP、2κCG–AuNP和2.25κCG–AuNP水凝胶的AFM图像和高度剖面图。从图2(b)–(d)的高度剖面图获得的特征峰表明，在κCG基质内合成的AuNPs主要是球形的，同时也存在一些导致不规则形状的聚集体。所有κCG–AuNP组合物的紫外-可见吸收光谱都接近540 nm，这是球形AuNPs的标准吸收波长（图2(a)）。根据Belloti等人的研究，使用AFM测量球形AuNPs的直径时，最准确的方法是通过测量从截面剖面获得的高度（z轴），而不是x–y横向尺寸。这主要是因为AFM探针具有有限的形状和大小，可能会导致一种称为探针膨胀的宽化效应。这种现象使得纳米粒子在x–y平面上的直径看起来比实际直径更宽。相比之下，高度或z轴不受探针形状和大小的影响，因此通过测量截面剖面的高度来测量AuNPs的直径是一种更可靠的方法。因此，按照上述方法，我们认为球形AuNPs的真实直径是从截面剖面获得的最高高度，从而避免了由探针膨胀引起的任何误差。从图像中获得的AuNPs的平均高度范围为10到35 nm。SAXS分析进一步支持了AFM的结果，表明AuNPs在凝胶网络中分布均匀，其平均直径在15–16纳米之间，这适用于不同的κCG组成（见图S3(c)）。吸收峰显著受到形成的纳米颗粒的大小和形状的影响。已证明AuNP聚集体的存在或它们尺寸的增加会导致最大吸收峰的移动或展宽。如图2(a)所示，所有三种组成的κCG–AuNP水凝胶显示出相似的吸收峰和最大值。因此，这三种不同κCG–AuNP水凝胶中合成的AuNPs的形状和大小也可能相似，这一点通过图2(b)–(d)所示的横截面高度剖面得到了证实。此外，通过DLS获得的数重量分布剖面也证实，在所有κCG组成中原位合成的AuNPs的流体动力学直径是相似的（见图S1）。所有κCG–AuNP组成的平均流体动力学直径约为758纳米。众所周知，光散射强度与颗粒半径的六次方成正比，因此DLS对较大颗粒更为敏感。因此，我们报告了κCG中AuNPs的数重量分布。从DLS得出的尺寸比AFM观察到的要大，因为AuNPs在与各自的κCG聚合物组成结合时处于膨胀状态，导致形状复杂且表面粗糙度增加。此外，诸如氢键、范德华力和π–π相互作用等各种相互作用可能导致聚合物包覆的AuNPs的配位球体增大。图2(a)中三种组成的κCG–AuNP水凝胶的最大吸收峰强度表明，随着κCG重量百分比的增加，水凝胶中合成的AuNPs的数量也增加。Wan等人之前在含有18 mg/mL（1.8% w/v）κCG的溶液中原位合成了AuNPs。最佳反应条件包括80°C的温度、30分钟的反应时间和0.4 mM的HAuCl4浓度。透射电子显微镜（TEM）分析显示，纳米颗粒的平均尺寸在13.5纳米到18.6纳米之间。álvarez-Vi?as及其同事展示了在0.25 mg/mL（0.025% w/v）卡拉胶溶液中，随着氯金酸浓度的增加，可以生成更大的假球形纳米颗粒（尺寸范围从14纳米到36纳米）。此外，Débora A. de Almeida等人合成了具有563 ± 7纳米流体动力学尺寸的κCG包覆AuNPs。有充分的文献记载，原位形成的AuNPs的形状和大小取决于反应条件；然而，我们样品中获得的AuNPs的尺寸范围与现有文献一致。由于无论探索的κCG浓度如何，合成的AuNPs的尺寸范围都保持不变，因此由AuNPs尺寸变化引起的流变和机械性能的任何差异都不会明显，这使我们能够将κCG的浓度确定为空心管机械稳定性的主要驱动因素。原位合成AuNPs还通过所有组分的冻干κCG水凝胶的FTIR光谱中特征性的O–H伸缩带的微妙移动得到了进一步证实（见图S2）。所有组成的κCG–AuNP水凝胶的-O–H伸缩带与原始κCG水凝胶的O–H带相比都发生了2–12 cm?1的移动。这些移动可能是由于羟基参与了Au3+离子的配位，从而有助于AuNPs在κCG基质中的成核和稳定。同时，O–H伸缩区域的扰动表明κCG链之间的分子间氢键部分被破坏，这可能是由于κCG羟基与AuNP表面的竞争性相互作用所致。次级带在2904–2910 cm?1、1636–1640 cm?1、1372–1374 cm?1、1224–1227 cm?1、1035–1036 cm?1、918–922 cm?1、842–844 cm?1和698–700 cm?1处显示出κCG的特征特征，分别对应于C–H伸缩、结合水振动、CH2平面弯曲、S–O伸缩、3,6-无水-d-半乳糖的C–O–C伸缩以及硫酸酯和C-4半乳糖上的O–S–O对称振动。这些带没有显著变化表明，在引入AuNPs后，κCG的主要多糖骨架在结构上保持完整。

3.2. 同轴挤出

为了确定实现从同轴喷嘴均匀挤出的最佳流速，对不同组成的原始κCG和κCG–AuNP水凝胶进行了可挤出性测试，使用的流速范围从0.5到5 mL min?1。如图3(a)所示，0.5 mL min?1的流速不足以将任何组合从同轴喷嘴中挤出。在1 mL min?1的流速下，无论是原始κCG还是κCG–AuNP水凝胶，最高重量百分比的组合物都无法挤出，只有2κCG和2κCG–AuNP组合物观察到了液滴的形成。只有在最低组成的1.5κCG和1.5κCG-AuNP中，才能在1 mL min?1的流速下实现均匀挤出；然而，在初始阶段经常发生纤维断裂。在2、2.5和3 mL min?1的流速下，除了1.5κCG外，所有组合物都普遍存在纤维断裂的问题，而1.5κCG在开始时表现出最小的断裂频率。在最高的5 mL min?1流速下，所有组合物都成功实现了均匀挤出，且断裂频率最低，从而产生了连续且较长的纤维。图3



(a) 从预制同轴喷嘴（16G-20G）中挤出的不同组成的原始κCG和κCG–AuNP水凝胶的可挤出性图；(b) 和 (c) 在KCl浴中浸泡后的挤出纤维的图像（刻度尺：1 cm）。根据上述分析，选择3 mL min?1和5 mL min?1进行进一步研究，因为只有在这两个流速下观察到了所有组合物的连续挤出。考虑到高剪切率可能对封装细胞产生的负面影响，未测试超过5 mL min?1的流速。图3(b)和(c)显示了在100 mM KCl浴中浸泡后，两种选定流速下挤出的κCG–AuNP和原始κCG纤维的形态。当使用5 mL min?1的较高流速时，无论是κCG–AuNP还是原始κCG水凝胶，都获得了更长的纤维（>50 cm）。通过使用立体显微镜成像（见图4(a)和(b)）评估了同轴挤出空心通道的尺寸。由2κCG、2.25κCG、2κCG–AuNP和2.25κCG–AuNP水凝胶制成的纤维的横截面图像显示了空心管道，证实了在3 mL min?1和5 mL min?1的流速下完全去除了Pluronic F-127的牺牲核心。此外，我们还进行了1.5κCG–AuNP和1.5κCG水凝胶的同轴挤出，如图S4所示。从1.5κCG–AuNP和1.5κCG水凝胶中产生的纤维显示出内腔塌陷或横截面破裂（见图S4）。图4



(a) 同轴挤出的不同组成的κCG–AuNPs空心通道的横截面立体显微镜图像；(b) 原始κCG（刻度尺：500 μm）；(c) 和 (d) 套层生物聚合物的流速对κCG–AuNP和原始κCG水凝胶的内径（I.D.）、外径（O.D.）和壁厚（wall thickness）的影响。使用Tukey检验进行了一元方差分析，p < 0.05被视为统计上显著，图中用‘*’表示（n = 10或n = 15）。内径、外径和壁厚的尺寸通常取决于套层生物聚合物的流速。先前的研究表明，增加套层的速度会导致空心纤维的外径增大。图4(c)和(d)展示了κCG通过外喷嘴的流速对空心内腔直径、外径和壁厚的影响。流速从3 mL min?1增加到5 mL min?1显著增加了2κCG–AuNPs的壁厚。然而，除了上述情况外，在2.25κCG–AuNP或原始2κCG和2.25κCG水凝胶纤维中，内径、外径或壁厚没有观察到显著差异。为了评估使用该装置制备的空心通道尺寸的可重复性，我们进行了5次独立的挤出实验，并随后在立体显微镜下对15个横截面进行了尺寸量化。表1显示了空心通道的内径（I.D.）、外径（O.D.）、壁厚和圆度的平均值和标准差，而变异系数（CV）则报告在表2中。根据文献，CV ≤ 30%被认为是实验间可接受的。如表2所示，所有测量参数的CV均低于此阈值，表明挤出过程产生了具有满意可重复性和尺寸一致性的结构。表1



原始κCG和κCG–AuNP空心通道的平均尺寸



流速
3 mL min?1
5 mL min?1



组成
I.D.（μm）
O.D.（μm）
壁厚（μm）
圆度
I.D.（μm）
O.D.（μm）
壁厚（μm）
圆度



2κCG–AuNPs
658.2 ± 89.5
1018 ± 108.5
180.3 ± 51.1
0.88 ± 0.04
651 ± 86.1
1052.5 ± 78.9
200.7 ± 26.4
0.89 ± 0.06



2κCG
648.4 ± 114.3
1008.4 ± 101.2
180 ± 50.3
0.82 ± 0.09
676.5 ± 74.3
1008.3 ± 57.2
166.0 ± 25.0
0.87 ± 0.08



2.25κCG–AuNPs
625 ± 131.7
1028.3 ± 88.9
201.7 ± 42.2
0.85 ± 0.07
695.1 ± 58.5
1064.4 ± 71.5
184.7 ± 34.8
0.90 ± 0.03



2.25κCG
693.3 ± 83.7
1018 ± 79.3
162.4 ± 25.6
0.89 ± 0.06
718.1 ± 63.4
1000.3 ± 48.1
141.1 ± 41.3
0.92 ± 0.04



表2

原始κCG和κCG–AuNP空心通道的内径（I.D.）、外径（O.D.）、壁厚和圆度的CV%



流速
3 mL min?1
5 mL min?1



组成
I.D. CV%
O.D. CV%
壁厚 CV%
圆度 CV%
I.D. CV%
O.D. CV%
壁厚 CV%
圆度 CV%



2κCG–AuNPs
13.6
10.7
28.3
4.5
13.2
7.5
13.2
6.7



2κCG
17.6
10
28
11
11.0
5.7
15.1
9.2



2.25κCG–AuNPs
21.1
8.6
20.9
8.2
8.4
6.7
18.8
3.3



表2中的圆度指数在0.82到0.92之间，表明在不同流速下挤出的纤维横截面更接近于完美的圆形（圆度指数为1），而不是拉长的形状（圆度指数为0）。因此，所有组成的κCG和κCG–AuNP水凝胶在通过100 mM KCl浴在4 °C下浸泡30分钟去除Pluronic F-127核心后，都能够形成圆形的自支撑空心内腔。



3.3. 穿透性

为了评估在去除牺牲核心后挤出管状结构中形成均匀空心通道的情况，进行了染料注入测试，以确定它们的穿透性（见图5及附带的数据说明中的视频）。只有较短的纤维在3 mL min?1的流速下挤出时实现了成功渗透，这些纤维的长度在2至3厘米之间，适用于所有组成的κCG和κCG–AuNP。此外，在手动处理这些较短纤维时，断裂的发生率较高。图5



通过不同流速同轴挤出的κCG和κCG–AuNP管状结构的空心内腔的食品染料渗透（刻度尺：1 cm）。相比之下，在流速为5 mL min?1的条件下挤出的较长纤维（长度大于5厘米）中观察到了连续的染料流动，适用于所有组成的κCG和κCG–AuNP。在这些纤维中，由2κCG–AuNP制成的最长纤维在渗透测试中最为成功，没有发生断裂，如图5所示。为了更好地理解κCG的浓度、AuNPs的影响、离子交联浴的作用以及挤出流速如何有助于形成具有自支撑空心内腔的纤维，我们使用旋转流变学和拉伸流变学对水凝胶进行了表征，具体细节将在以下章节中详细介绍。



3.4.流变学研究

对原始κCG和κCG–AuNP水凝胶进行了全面的流变学表征，以捕捉它们在挤压和相关于挤压后交联条件下的粘弹性和剪切流行为（见图6）。在37°C的挤压温度下，对原始κCG和κCG–AuNP水凝胶进行了小幅度振荡频率扫描（SAOS）实验。对所有墨水组成进行了大幅度振荡应变扫描（LAOS），以确定线性粘弹性区域（LVR），如图S5(a和b)所示。通过流动曲线展示了37°C挤压温度下水凝胶的剪切变稀特性。为了评估用于水凝胶纤维挤压后交联的100 mM KCl交联浴的影响，在100 mM KCl交联浴中孵育后，对原始κCG和κCG–AuNP水凝胶圆盘进行了小幅度振荡频率扫描。图6

图(a) (i) 频率扫描显示了不同组成的原始κCG和κCG–AuNP的储模量（G′）；(ii) 频率扫描显示了不同组成的原始κCG和κCG–AuNP的损耗模量（G″）；(iii) 比较了不同组成的原始κCG和κCG–AuNP在1 rad s?1时的G′；图(b) 流动曲线显示了(i) 原始κCG水凝胶；(ii) κCG–AuNP水凝胶的粘度随剪切率的变化；(iii) 所有κCG–AuNP和原始κCG水凝胶的n和K值；图(c) 不同组成的(i) κCG和(ii) 在100 mM KCl浴中交联的κCG的频率扫描；(iii) 比较了不同组成的原始κCG和κCG–AuNP在1 rad s?1时的G′，在37°C下在100 mM KCl交联浴中孵育前后。使用Tukey检验进行单因素方差分析，p < 0.05被认为具有统计显著性，在图中用‘*’表示（n = 3）。

3.4.1. 原始κCG和κCG–AuNP水凝胶的频率扫描

所有组成都显示出储模量（G′）大于损耗模量（G″），表明在整个角频率测量范围内表现出弹性凝胶状行为，如图6的图(a) (i)和(ii)所示。观察到随着κCG重量百分比的增加，原始κCG和κCG–AuNP水凝胶的G′值也增加了。2.25κCG和2.25κCG–AuNP水凝胶分别表现出最高的G′和G″值。在κCG和κCG–AuNP水凝胶之间，κCG组成的G′值更高。具体来说，1.5κCG–AuNP、2κCG–AuNP和2.25κCG–AuNP水凝胶在1 rad s?1时的G′值分别是1.5κCG、2κCG和2.25κCG水凝胶的1.53、1.96和1.64倍，如图6的图(a) (iii)所示。我们的发现与Satish等人之前的报告一致，他们合成了大小为11 ± 2 nm的金纳米球，用于制备适合生物打印的导电生物墨水。55 在评估水凝胶的流动曲线时，观察到原始羧甲基纤维素的粘度高于原位合成的羧甲基纤维素。同样，含有AuNP的水凝胶在LAOS和SAOS中的G′显著低于原始水凝胶，但没有改变水凝胶的流动或粘弹性特性。作者通过XRD分析确认了羧甲基纤维素中的羟基（–OH） groupe减少了Au离子，将金纳米球固定在水凝胶基质中。然而，这种现象降低了聚合物链之间的互连性，导致水凝胶更软，G′和粘度低于原始水凝胶。同样，我们认为κCG中的羟基将HAuCl4还原为Au0，从而通过作为封端剂稳定了原位合成的AuNPs。由于κCG聚合物链与AuNPs之间的相互作用增加，导致聚合物链之间的氢键相互作用减少，如图FTIR结果所示，形成了更软的水凝胶，G′降低。此外，所有样品的损耗正切（tanδ）范围从0.06到0.31，表明它们表现出弹性固体状行为。损耗正切定义为G″与G′的比值，如上述方程（2）所示。当tanδ超过1时，表示液体状特性；而低于1的值对应于更固体状的行为。56

3.4.2. 原始κCG和κCG–AuNP水凝胶的流动曲线

如图6的图(b) (i)和(ii)所示，当剪切率从0.2 s?1增加到20 s?1时，κCG–AuNP和κCG水凝胶的粘度都迅速下降。此外，在0.2 s?1时测得的低剪切粘度与原始κCG和κCG–AuNP水凝胶中κCG的重量百分比成正比。Kim等人先前使用流动曲线证明，当与固定浓度的CaSO4交联时，藻酸盐-卡拉胶复合水凝胶的粘度随着卡拉胶浓度的增加（从0.5% (w/v)到1.5% (w/v)而增加。57 通过根据方程（3）拟合幂律数学模型进一步量化了剪切变稀特性。图S6显示了1.5κCG–AuNP和1.5κCG水凝胶的流动曲线数据模型拟合，以估计参数n和K。剪切变稀流体的特点是n < 1。因此，从图6的图(b) (iii)可以推断，所有组成的κCG水凝胶都表现出剪切变稀曲线，n值接近0.2。κCG–AuNP和κCG水凝胶的K值随着κCG重量百分比的增加而增加。此外，所有组成的κCG–AuNP水凝胶的K值都低于κCG水凝胶，表明由于AuNPs的掺入，粘度降低。

3.4.3. 用100 mM KCl交联浴交联的水凝胶墨水的频率扫描

为了确定线性粘弹性区域（LVR），进行了大幅度振荡应变扫描，结果如图S5(c)和(d)所示。在1.5κCG–AuNP水凝胶中浸泡在100 mM KCl浴中半小时后，我们观察到G′与在37°C挤压温度下测得的G'相比增加了49倍（见图6，图c (iii)）。同样，对于2κCG–AuNP和2.25κCG–AuNP水凝胶，我们分别观察到G′增加了25倍和19倍。对于1.5κCG水凝胶，在100 mM KCl溶液中的孵育导致G′与在37°C下的储模量相比增加了34倍。同样，对于2κCG和2.25κCG水凝胶，在100 mM KCl溶液浴中孵育后，我们分别观察到G′增加了14倍和12倍。1.5κCG水凝胶在100 mM KCl交联浴中孵育30分钟后G′的增加对于在去除牺牲芯后形成自支撑的中空纤维至关重要。尽管1.5κCG水凝胶的G′增加了34倍，1.5κCG–AuNP水凝胶的G′增加了49倍，但两种类型的纤维都表现出内腔塌陷和横截面破裂（见图S4）。Kim等人报告称，2.5% (w/v)的藻酸盐溶液与0.2% (w/v)的CaCl2交联，产生G′为500 Pa的组成是生产最接近直线的纤维的最佳组成，无芯泄漏，适用于同轴打印。58 因此，尽管1.5κCG–AuNP和1.5κCG水凝胶在交联浴中的挤压后G′增加了超过1000 Pa，但在37°C挤压温度下它们相对较低的G′值分别为211 Pa和324 Pa，可能会导致纤维在沉积到交联浴后塌陷和破裂。所有水凝胶在37°C挤压温度下的线性粘弹性区域，以及交联浴后培养的κCG水凝胶，通过大幅度振荡应变扫描测试进行了表征（见图S5）。在低幅度应变下没有观察到模量的变化；然而，随着应变的增加，G′的下降表明水凝胶发生了变形。G′和G″相交的点被称为临界应变，超过这一点G″占主导地位，表明液体状行为（见图S7(a)）。从图S7(b)可以看出，无论κCG的重量百分比或是否含有AuNPs，浴交联的水凝胶的临界应变都降低了。如图S7(b)所示，1.5κCG–AuNP水凝胶的临界应变是83.5%，而浴交联的1.5κCG–AuNP水凝胶的临界应变仅为0.65%。同样，2κCG–AuNP和2.25κCG–AuNP水凝胶在挤压后交联的浴中的临界应变分别从49.7%和14.4%降低到0.56%和0.47%。1.5κCG、2κCG和2.25κCG水凝胶的组成 juga显示出临界应变从44.2%降低到0.55%，从30.9%降低到0.63%，以及从17.9%降低到0.58%。

3.5. 机械表征

κCG和κCG–AuNP水凝胶在100 mM KCl浴中交联前后的压缩模量、断裂载荷和断裂应变在图7中呈现。图S8显示了2κCG–AuNP水凝胶的应力-应变图的线性区域的模型拟合。图7

在100 mM KCl浴中交联前后，不同组成的κCG和κCG–AuNP水凝胶的机械性能，(a) 压缩模量，(b) 断裂前的最大载荷能力，以及(c) 断裂前的最大应变。使用Tukey检验进行单因素方差分析，p < 0.05被认为具有统计显著性，在图中用‘*’表示（n = 3）。在100 mM KCl浴中孵育后，观察到2κCG水凝胶的压缩模量有显著增加。尽管其他组成没有获得统计差异，但浴交联水凝胶的平均压缩模量值始终高于未在100 mM KCl浴中孵育的相同组成。图7(b)表示水凝胶在破裂前可以承受的最大载荷，这也与在100 mM KCl浴中交联后所有组成的显著增加一致。此外，图7(c)显示了交联后平均最大应变的增加趋势；然而，只有2.25κCG–AuNPs在100 mM KCl中交联前后的统计显著性得到了观察。值得注意的是，所有水凝胶在交联浴中的压缩模量范围在165到303 kPa之间，而在交联浴中孵育后增加到218–360 kPa，这比之前用于生物打印可灌流结构的藻酸盐基水凝胶（34.5–50.7 kPa）和血管管（6.58–8.38 kPa）的压缩模量要高。59,60 上述结果表明100 mM KCl交联浴在改善水凝胶的机械性能方面起着关键作用，确保了挤压后灌流通道的稳定性。

3.6. 水凝胶纤维的夹断动态

在所有κCG和κCG–AuNP水凝胶中观察到了随时间变化的纤维变细行为。为了说明这一点，图8展示了一系列图像，显示了在5 mL min?1的流速下κCG–AuNP水凝胶的纤维变细过程。在比较2κCG–AuNP水凝胶与其他两种类型时，可以明显看出纤维夹断的显著差异。2.25κCG–AuNP和1.5κCG–AuNP水凝胶在夹断前的伸长较少。相比之下，2κCG–AuNP样品在夹断前经历了更长的纤维变细过程，在此过程中纤维延伸成更细的线。图8

通过在基底上以5 mL min?1的流速滴落，观察了κCG–AuNP水凝胶纤维直径的变细过程（比例尺：5 mm）。这些图像序列已经量化，图9(a)和(b)中显示了相应的图表。除了1.5κCG和1.5κCG–AuNP水凝胶没有形成纤维外，我们观察到AuNPs的存在增加了在3 mL min?1和5 mL min?1挤压速率下的纤维断裂或夹断时间。2κCG–AuNP水凝胶在5 mL min?1的挤压速率下表现出最长的纤维断裂时间。这一发现与我们在图5中呈现的灌流测试期间的观察结果一致。先前关于其他生物聚合物的研究，如黄原胶、硬葡聚糖水凝胶和纳米复合溶液，也研究了夹断动态，以探讨纤维断裂时间与生物聚合物溶液和水凝胶组成的关系。61,62


图9

对于所有κCG和κCG–AuNPs的组成，绘制了随时间变化的直径演变图，分别在(a) 3 mL min?1的流速和(b) 5 mL min?1的流速下。在表3中，我们总结了从图9(a)和(b)的指数区域计算出的拉伸松弛时间(λ)。这种计算是通过拟合方程(4)来进行的，如图S9所示。在5 mL min?1的流速下挤出的2κCG–AuNP水凝胶纤维表现出最高的拉伸松弛时间。这表明材料在拉伸变形下需要更长的时间来松弛其应力，显示出显著的抗拉伸性，行为更像固体。32 这种类固体的行为可能是由于AuNPs在单轴张力下促进分子排列的作用。虽然这种机制尚未得到广泛探索，但我们的发现表明，纳米粒子-聚合物相互作用可以显著影响纤维变细动态。特别是在2κCG–AuNPs中，可能存在聚合物-纳米粒子相互作用的最佳平衡，使得在单轴张力下链排列更好，纤维断裂更慢，从而改善了松弛时间，尽管它是一种较软的凝胶（G′较低）。尽管2.25κCG–AuNP表现出较高的G′，但其夹断时间较短，纤维伸长也较小。这反映了挤压驱动的纤维稳定性是由刚度和拉伸粘弹性之间的平衡控制的，而不仅仅是由G′决定的。较长的拉伸松弛时间λ表明，在颈缩过程中弹性应力持续存在，并且可以显著延迟毛细管的断裂，从而在夹断前产生更长更细的纤维。2κCG–AuNPs可能结合了足够的剪切刚度和最高的λ，表明在单轴拉伸下具有最佳的可拉伸性，弹性占主导。相比之下，2.25κCG–AuNP可能具有更受限的网络，在这种网络中，过量的聚合物限制了链排列和弹性回弹，降低了有效拉伸弹性，尽管G′较高。因此，对于同轴挤压出的空心纤维，较软的2κCG–AuNP组成提供了更好的纤维稳定性，因为其拉伸响应更符合夹断过程的要求。

表3

κCG和κCG–AuNP水凝胶的拉伸松弛时间(λ)

组成
表面张力 (mN m?1)
松弛时间 λ (s)

3 mL min?1
5 mL min?1

1.5κCG–AuNPs
69.11 ± 2.2
0.0130 ± 0.001
0.0121 ± 0.001

1.5κCG
62.89 ± 2.4
0.007 ± 0.001
0.008 ± 0.001

2κCG–AuNPs
67.20 ± 3.2
0.113 ± 0.003
0.116 ± 0.002

2κCG
64.49 ± 1.7
0.046 ± 0.001
0.055 ± 0.003

2.25κCG–AuNPs
68.20 ± 2.7
0.032 ± 0.002
0.078 ± 0.002

2.25κCG
66.69 ± 1.9
0.021 ± 0.001
0.026 ± 0.001

尽管直接针对纳米复合水凝胶这种行为的文献有限，但对缠结聚合物溶液的研究表明，尽管G′增加，拉伸松弛时间比率却会降低。63 此外，其他不相关的系统，如蛋白质纤维和多糖溶液，也显示拉伸流变学揭示了在剪切流变学中不明显的微观结构效应。64,65

图10展示了根据方程(6)和(7)计算出的拉伸速率与拉伸粘度之间的关系。使用纤维拉伸方法也记录了类似的趋势，即拉伸粘度随着拉伸速率的增加而降低。66 这种现象的特点是在拉伸过程中对变形的抵抗力降低，被称为张力稀释行为或拉伸稀释。41,43,67 在所有组成中，无论κCG浓度如何或是否存在AuNPs，初始拉伸速率下观察到的曲线重叠，表明κCG的解卷和拉伸在每种情况下都是类似的。

图10展示了在(a) 3 mL min?1流速和(b) 5 mL min?1流速下，κCG和κCG–AuNP水凝胶的拉伸粘度与拉伸速率之间的关系。灌注实验、旋转流变学研究和夹断动态表明，在所有水凝胶配方中，以5 mL min?1的流速挤出的2κCG–AuNP水凝胶成功形成了自我支撑的空心纤维。这些纤维在手动处理过程中表现出抗断裂性，这可以归因于初始G′足够高，并且在100 mM KCl浴中交联后进一步增加，突显了它们的主要弹性特性。因此，我们选择在选定的5 mL min?1流速下使用同轴挤压将A549肺癌细胞封装在2κCG–AuNP水凝胶中，以创建载有细胞的空心纤维。

3.7. 载有细胞的凝胶的流变学特征

在评估同轴挤压后，封装在2κCG–AuNP和2κCG纤维中的A549肺癌细胞的细胞活力之前，我们首先研究了细胞封装如何影响2κCG–AuNP和2κCG水凝胶的旋转和夹断动态。对于含有细胞的和不含细胞的组成，大幅度振荡应变扫描和小幅度振荡频率扫描的结果表明，每毫升添加2 × 10^6个A549肺癌细胞导致2κCG和2κCG–AuNP水凝胶的G′略有下降（图11）。流动曲线显示，与不含细胞的凝胶相比，含有细胞的2κCG和2κCG–AuNP水凝胶在较低剪切速率下的粘度增加。图11

(a和c) 比较了原始2κCG和2κCG–AuNP水凝胶中封装A549和不含细胞的组分的幅度振荡应变扫描；(b和d) 比较了原始2κCG和2κCG–AuNP水凝胶中封装A549和不含细胞的组分的频率扫描；(e和f) 比较了原始2κCG和2κCG–AuNP水凝胶中封装A549和不含细胞的组分的流动曲线。从夹断动态实验（图S10）获得的A549封装和不含细胞的2κCG水凝胶以及2κCG–AuNP水凝胶的纤维直径衰减显示出相似的趋势，除了在断裂过程的末尾。计算的拉伸松弛时间（如表S3所示）对于封装细胞的2κCG和2κCG–AuNP水凝胶，以及不含细胞的2κCG和2κCG–AuNP水凝胶，并没有显著差异。Diamantides等人研究了软骨细胞包含对基于胶原的生物墨水的流变特性的影响，细胞密度非常高，范围在5 × 10^6到100 × 10^6个细胞/毫升之间，对应的细胞体积分数为0–0.18。68 在他们的研究中，细胞密度的增加导致胶原G′的降低。尽管在我们的研究中，2κCG和2κCG–AuNP水凝胶中A549肺癌细胞的细胞密度为每毫升2 × 10^6个细胞，与Diamantides等人报告的密度相比较低（大约为0.0061），我们观察到G′略有下降，并且在低剪切下粘度增加。在这个低细胞体积分数下，封装的细胞可能作为软质包裹物，破坏了聚合物网络，从而略微降低了G′，同时增加了稳态剪切下的流体动力阻力。同样，Zhang等人报告说，将细胞引入藻酸盐基墨水中会导致剪切粘度增加，而G′没有显著变化。69

3.8. 细胞活力

如图12所示，A549细胞成功封装在2κCG和2κCG–AuNP组成中，细胞密度为每毫升2 × 10^6个细胞。图12(a和b)中的图像清楚地展示了封装在纤维壁中的细胞和空心通道。图S11展示了2κCG和2κCG–AuNP水凝胶的3D z-堆栈，显示了A549细胞在整个导管壁中的均匀分布。2κCG和2κCG–AuNP空心导管的共聚焦z-堆栈根据切片总数被分为四个相等的区域，并且每个区域都量化了活细胞和死细胞（表S4和S5）。每个z-堆栈区域表示沿着成像深度的导管壁的一个连续部分。表S4中总细胞数或沿z轴的活力没有单调梯度，表明封装均匀，且在挤压过程中没有显著的细胞沉积。在表S5中，尽管随着成像深度的增加总细胞数有所减少，但重力沉积本应在底部导致细胞数增加，但这并未观察到。此外，所有区域（75–80%）的均匀细胞活力表明2κCG–AuNP空心导管中没有深度依赖的细胞毒性。图12

(a和b) 分别是2κCG和2κCG–AuNP水凝胶纤维壁中封装A549肺癌细胞的z-堆栈的最大强度投影，以及空心通道的存在；(c) 在5 mL min?1的流速下挤压24小时后的细胞活力。在2κCG和2κCG–AuNP水凝胶中，封装的细胞呈现出圆形形态，并在整个纤维壁中均匀分布。这可能是因为A549细胞由于κCG多糖中缺乏粘附位点而不会粘附在生物聚合物链上。70

为了定量评估同轴挤压过程后以及暴露于100 mM KCl交联浴24小时后的细胞存活情况，进行了活/死染色程序。在2κCG水凝胶的空心导管中观察到的细胞存活率为62.2 ± 7%，而在2κCG–AuNP水凝胶的空心导管中的存活率为69.2 ± 14.6%。2κCG和2κCG–AuNP的G′（约1 kPa）与健康猪肺组织的G′相匹配，从而确保了制造出生理相关的体外模型。71 基于上述文献，为了进一步研究这些细胞在完整的3D微环境中的生物相容性，我们决定将A549细胞完全封装在报告的水凝胶组成中，以评估它们在需要多材料挤压的更复杂形状中的活力。由于当前研究关注材料和工艺优化以及初步的生物相容性，选择整体封装细胞也符合我们评估挤压后细胞存活和材料-细胞相互作用的目标。图12(c)表明，κCG聚合物中的AuNPs的存在并未对封装的A549细胞产生额外的毒性。为了隔离交联剂的影响，我们进行了2D对照实验，将A549细胞暴露于10 mM KCl中24小时，以及暴露于100 mM KCl中30分钟，温度为4°C，这与合成κCG水凝胶和制造空心导管时使用的条件相同。与2D对照培养物相比，没有观察到显著的细胞死亡，表明残留的KCl对细胞存活没有离子或渗透效应，这在挤压空心导管后24小时进行了测量（图S12）。尽管AuNPs在体外和体内都已知具有较低的急性毒性，但它们的大小、形状、包覆剂和细胞系类型在其毒性效应的决定中起着关键作用。小球形AuNPs（1.2 nm–1.4 nm），无论表面化学性质如何，都已知会导致细胞凋亡和坏死。72 相反，不同形状的AuNPs，如棒状或较大尺寸的花朵形和棱柱形AuNPs，通常被认为更安全。73 根据现有文献，尺寸在10 nm到40 nm之间并具有特定表面改性的AuNPs已被证明可以保持良好的细胞活力。例如，大约14 nm大小的AuNPs，在低浓度的κCG中合成时，对肺癌上皮细胞A549没有显著的细胞毒性。30 同样，Zhang等人在海藻酸盐基墨水中合成了尺寸在23到81 nm之间、平均尺寸为40 nm的AuNPs，这些AuNPs对L929小鼠成纤维细胞的细胞毒性仅为<80%，仅在凝胶播种浓度非常高时。74 此外，Zhang等人在壳聚糖凝胶中合成了尺寸从23到81 nm不等的AuNPs，平均尺寸为40 nm。这些壳聚糖纳米凝胶与HepG2细胞生物相容，细胞活力超过100%。75 同样，我们也优先考虑在安全尺寸范围（10–35 nm）内形成AuNPs，以确保在含细胞的空心管中没有额外的细胞毒性。此外，通过在完全酸消化冻干支架后使用ICP-OES量化了2κCG–AuNPs中的AuNPs浓度。该组成显示出金浓度为64.6 ppm（ mg kg?1的凝胶），证实测量的浓度位于报告的生物相容性范围内。Samadian等人之前的研究表明，在聚（L-乳酸）（PLLA）基水凝胶支架上培养的MG-63细胞中，40-80 ppm的金纳米粒子（AuNP）负载量并未引起任何显著的细胞毒性。76

尽管AuNP没有细胞毒性，但2κCG和2κCG–AuNP水凝胶中细胞的整体存活率分别为62%和69%，低于文献中报道的约75-95%的范围（表4）。然而，需要注意的是，将细胞封装在水凝胶中会导致挤压前细胞大量死亡。77-80 此外，为了获得连续挤压出较长的纤维，所优化的流量为5 mL min^-1，这比文献中报道的流量要高。例如，Yu等人证明，随着分配压力的增加，在藻酸盐中封装并通过同轴喷嘴生物打印的细胞存活率从68%下降到40%。81 因此，挤压过程也由于高剪切率而对细胞产生了不利影响。使用复杂的同轴挤压生物打印机未来的应用可以减轻挤压过程中的剪切相关损伤。虽然由于缺乏粘附位点，A549细胞在水凝胶空心纤维内呈现球形形态，但研究表明，像成纤维细胞这样的封装细胞具有随着时间在κCG水凝胶中自我组织成3D球体的内在潜力。16 因此，延长封装细胞在κCG空心水凝胶管中的培养时间可能通过细胞迁移和球体形成来提高细胞存活率。尽管存在上述限制，细胞存活率的结果明确表明，κCG及其金纳米复合材料衍生物在更复杂的设置中具有生物打印复杂几何形状的潜力，为开发用于药物筛选和疾病建模的体外核心-壳共培养模型奠定了基础。表4

与先前研究的生物聚合物相比的当前研究中的水凝胶


鞘生物聚合物
核心
交联浴
同轴喷嘴尺寸
挤压类型
鞘生物聚合物上的流量范围/压力
外径（μm）
内径（μm）
壁厚（μm）
G′（Pa）/粘度（Pa s）
24小时后的细胞存活率
参考文献 藻酸盐
CaCl2
—
14G–18G
注射泵
0.5–2 mL min^-1
950–1400
600–1000
100–200
—
—
82


CaCl2
CaCl2
18G–30G
注射泵
200–500 μL min^-1
1500–2000
250
约625
—
95%（在空心腔内播种的细胞）
83


CaCl2
CaCl2
16G–21G
注射泵
0.5–1.5 mL min^-1
1000–1300
600–1000
约150–200
—
92.9 ± 2.4%（封装的细胞）
6


PVA
—
25.8 mm L × 4.0 mm 外径
RX1生物打印机的Centra打印头
15–250 mbar
—
约400
约45–80
—
约75%（封装的细胞）
84


Pluronic F-127
Pluronic F-127
5G–9G
T&R Biofab生物打印机
120–160 kPa
3121 ± 80–2948 ± 54
—
339 ± 41–976 ± 25
40/10
在腔内播种的HUVECs
85


细胞悬浮液
CaCl2
16G–21G
注射泵
15–30 mL h^-1
870.87 ± 17.96–886.71 ± 9.83
242.89 ± 14.76–527.49 ± 13.36
313–179.61
—
96.36 ± 1.54%（在腔内播种的细胞）
86


SilkMA和GelMA
CaCl2
—
16G–22G
注射泵
0.5–1.5 mL min^-1
913 ± 14–1327 ± 17
741 ± 5–1077 ± 40
86–125
—
>80%（在腔内播种的细胞）
87


GelMA
明胶
—
17G/25G, 17G/26G, 17G/27G
生物打印机
0.2 mL min^-1
—
200–1000
—
>80%（封装的细胞）
88


原始κCG和κCG–AuNPs
Pluronic F127
KCl
16G–20G
注射泵和手动
3–5 mL min^-1
1000–2000
600–800
约200
1250/301, 639/262
62.2 ± 7%, 69.2 ± 14.6%（封装的细胞）
本研究


4. 与现有文献的比较

表4总结了过去十年使用注射泵和同轴生物打印机制造空心水凝胶管道的研究。空心管道的尺寸，即内径（I.D.）、外径（O.D.）和κCG空心水凝胶管的壁厚，是基于对常见制造的空心通道尺寸的文献回顾确定的。如表4所示，基于藻酸盐的空心水凝胶通道已被广泛研究，用于制造壁厚从超过600 μm到薄至45 μm的空心结构。藻酸盐通过Ca2+的快速交联可以在接触时立即凝胶化，从而形成具有强机械性能的管状结构。同样，另一种常用于同轴打印的UV交联GelMA也需要UV照射来引发交联并增强空心管道的机械性能。关于藻酸盐和GelMA的现有文献主要集中在将各种类型的细胞播种到空心腔内。这种播种过程可以通过核心喷嘴在同轴打印过程中直接进行，也可以在挤压后进行。这些方法允许评估细胞在腔内壁的存活率、扩散和增殖。这种方法有助于防止挤压过程中由剪切应力引起的细胞死亡，并减少生物聚合物中使用的交联剂造成的毒性。然而，包括Yin等人进行的一些研究尝试将细胞封装在鞘生物聚合物本身中。这种方法导致培养三天后的细胞存活率约为75%。84 虽然许多研究强调常用生物聚合物的较低粘度是便于制造空心管道的理想特性，但这些材料的流变性能尚未得到彻底研究，如表3所示。此外，现有文献主要关注纯生物聚合物或生物聚合物混合物。尽管纳米材料已经广泛用于3D生物打印，但在同轴生物打印和挤压中使用纳米复合水凝胶仍然有限。89,90

我们成功地制造了与文献中报告的尺寸相当的空心κCG腔。尽管一些研究通过芯-鞘挤压实现了更小内径（约200 μm）的制造，但它们难以进行定量分析和生物学测试。例如，Homan等人成功制造了直径低至150 μm的管状结构，但定量测试仅针对直径在400 μm到550 μm的管状结构进行。81 我们所瞄准的尺寸使我们能够进行定量测试，如细胞存活率测量，以及通过腔内灌注食用染料来确定空心通道的均匀形成。这些可渗透的通道不仅证实了均匀空心腔的形成，还促进了细胞间营养和代谢废物的适当交换。92 此外，我们研究中制造的空心管尺寸，外径在1000到1030 μm之间，内径在625–700 μm之间，紧密复制了肺部小支气管的管状几何结构。93 因此，获得的尺寸范围反映了肺部终末气道的微尺度架构，使得这些构造非常适合用于肺组织工程、疾病建模或药物筛选。



5. 结论和未来展望

在这项研究中，我们调查了原始κCG和κCG–AuNPs的关键参数，包括流速和成分，以评估它们对制造空心管道的影响。流变分析表明，低G′（<500 Pa）导致原始1.5κCG和1.5κCG–AuNPs的空心腔塌陷，而在较高成分下观察到完整的空心腔。渗透性测试和夹断动力学进一步表明，5 mL min^-1的更高流速产生了更长且机械完整性更好的纤维，特别是对于2κCG–AuNP。在原始κCG和κCG–AuNP负载的空心管道中，有大量细胞存活了同轴挤压过程。这些发现突出了所研究参数在确定最佳成分和挤压条件方面的重要性，这些条件对于使用更先进同轴设置扩展到模拟体外生物管状结构是必要的。除此之外，未来的研究可以探索改变氯金酸的浓度，以研究其对原位合成AuNPs大小的影响，以及因此对空心管道的挤压行为和精确度的影响。关于A549的3D封装的进一步研究可以包括延长培养时间以评估长期的细胞行为和功能性测试，以评估构造的组织特异性功能。作者贡献

Sanchari Swarupa：实验、数据收集、分析、写作；Mata Subhashita：夹断动力学实验、数据收集、分析、写作；Nikita Chauhan：SAXS实验、分析；Jitendra Bahadur：SAXS分析、写作；Sharad Gupta：细胞培养实验监督；Prachi Thareja：总体监督、审阅、资金获取和项目管理。利益冲突

作者声明没有可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。数据可用性

支持本文的数据已包含在补充信息（SI）中。补充信息包括：AuNPs的流体动力学尺寸分布、FTIR、SAXS模式和拟合参数、空心管道的横截面、流变分析、压缩模量计算、松弛时间测量、空心管道的共聚焦z堆栈图像、深度依赖的细胞分布分析和2D对照实验。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6ma00245e。致谢

Prachi Thareja感谢ANRF、DST、印度政府（Grant # CRG/2020/006088）的资助。作者们还要感谢IIT Gandhinagar的中央仪器设施提供共聚焦激光扫描显微镜和原子力显微镜，感谢Pranab Mohapatra教授（土木工程系）提供高速相机（DST项目编号IMP/2018/001320）。也感谢DST-FIST的资助。对于写作帮助，我们使用了Grammarly来回应这些AI提示：“Improve it”。本文中的一些图表是使用BioRender.com创建的。参考文献