《Veterinary Microbiology》：Clinical evaluation of a validated droplet digital PCR assay for the detection of Ehrlichia canis in ocular and blood specimens from seroreactive dogs
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犬单核细胞增多症（CME）中结膜拭子与全血样本的Ehrlichia canis DNA检测效能比较，发现数字PCR（ddPCR）敏感性最高（全血80.5% vs 结膜65.9%），且血液中病原载量与贫血及眼压降低显著相关，提示ddPCR可用于评估CME严重程度。
Krittanut Kanittakul | Peeravit Sumpavong | Natthanet Sritrakoon | Sarawan Kaewmongkol | Gunn Kaewmongkol
泰国曼谷卡塞萨特大学兽医学院兽医教学医院内科科
摘要
关于眼部分泌物在Ehrlichia canis感染犬中的诊断价值，现有数据非常有限。本研究评估了结膜拭子与全血在临床怀疑患有犬单核细胞埃立克体病（CME）的犬只中的诊断敏感性。共有41只血清学检测呈阳性的犬只（通过IDEXX SNAP 4Dx Plus试剂盒确定）被纳入研究，这些犬只表现出与CME一致的临床症状。从所有样本中提取DNA，并使用三种PCR方法进行检测：常规PCR（cPCR）、TaqMan实时PCR（qPCR）以及一种先前经过验证的滴液数字PCR（ddPCR），后者针对的是二硫键形成蛋白（dsb）基因。在血液样本中，cPCR、qPCR和ddPCR分别检测出22/41（53.7%）、25/41（61.0%）和33/41（80.5%）例E. canis DNA。而在结膜拭子中，检测率分别为0/41、11/41（26.8%）和27/41（65.9%）。所有PCR方法在血液样本中的敏感性均高于结膜样本，其中ddPCR的总体检测效果最佳。血液中的细菌载量显著高于结膜拭子（中位数分别为2.68 vs 0.76拷贝/μL，P?P?P?P?E. canis细菌载量与较低的血细胞比容（HCT，平均29%，P?=?0.03）和较低的眼内压（IOP，中位数9 mmHg，P?=?0.04）显著相关。总之，ddPCR被证明是一种高度敏感和精确的E. canis检测工具。尽管结膜拭子的侵入性较低，但其诊断效果需要高度敏感的检测方法。值得注意的是，E. canis DNA血症的水平与贫血的严重程度和降低的眼内压相关，这突显了ddPCR在评估CME疾病严重程度方面的潜力。
引言
Ehrlichia canis是一种革兰氏阴性专性细胞内细菌，是犬单核细胞埃立克体病（CME）的主要致病菌，其主要传播媒介是棕色犬蜱Rhipicephalus sanguineus（Villaescusa等人，2015年）。CME的临床表现包括厌食、发热、全身淋巴结肿大和出血倾向（Diniz和Moura de Aguiar，2022年；Frank和Breitschwerdt，2008年）。眼部病变较为常见，表现症状包括前葡萄膜炎、继发性青光眼、玻璃体出血、视网膜脱离和视神经炎（Komnenou等人，2007年；Nimsuphan等人，2020年；Piso等人，2021年）。眼部异常的严重程度与临床病理特征相关（Piso等人，2021年）。然而，仅在少数研究中报道了在结膜样本中检测到E. canis DNA（Baneth等人，2009年；Walser-Reinhard等人，2012年）。虽然直接从眼部样本中检测可以潜在地提高诊断敏感性，但尚未评估眼部样本中的细菌载量与疾病严重程度之间的关联。
多种PCR检测方法已被用于检测E. canis感染，但其诊断性能因所选技术而异。常规聚合酶链反应（cPCR）是一种简单的CME诊断方法，但其敏感性有限且存在污染风险（Sumpavong等人，2022年）。TaqMan探针实时PCR（qPCR）具有更高的敏感性，并能提供关于病原体载量的定量数据（Sumpavong等人，2022年）。
滴液数字PCR（ddPCR）是一种新型技术，无需标准DNA材料即可实现目标DNA的绝对定量（Quan等人，2018年）。该方法在水油乳液中生成微滴，将模板DNA分割成数千个独立 compartment，每个微滴内分别进行PCR扩增。此前已有研究证明ddPCR在E. canis感染中的优越性能（Wichianchot等人，2022年；Sumpavong等人，2026年）。
在人类医学领域，多项研究发现病原体载量与疾病严重程度、更高的死亡率以及升高的炎症生物标志物相关（Bauer等人，2023年；Tsukagoshi等人，2021年；Waterer和Rello，2011年）。然而，迄今为止尚未有研究评估E. canis载量与犬埃立克体病严重程度之间的关联。
本研究的目的是评估新型、侵入性较低的结膜拭子与标准全血样本在检测Ehrlichia DNA方面的诊断敏感性。此外，我们还比较了先前经过验证的ddPCR检测方法（Sumpavong等人，2026年）与常规PCR（cPCR）和qPCR在诊断具有急性CME临床症状的血清学阳性犬只中的效果。我们还使用定量分子技术研究了病原体载量与临床表现、疾病严重程度、眼部表现和血液学参数之间的关联。在本研究中，“DNA血症”指的是通过分子方法检测到的血液中Ehrlichia canis DNA的存在，尤其是那些难以用标准实验室技术培养的病原体。
研究设计、动物选择及纳入/排除标准
本研究在卡塞萨特大学机构动物护理和使用委员会批准的方案下进行（批准编号：ACKU67-VET-041）。2024年5月至2024年10月期间，共有41只出现CME临床症状的犬只被纳入研究，这些犬只均为卡塞萨特大学兽医教学医院（KUVTH）的就诊犬只。所有犬只的E. canis血清学检测结果均为阳性，通过商业试剂盒IDEXX SNAP 4Dx Plus确定。
犬只的临床特征和症状...
研究人群
最初共有41只血清学检测呈阳性的犬只（通过IDEXX SNAP 4Dx Plus确定）被纳入研究。其中24只为雄性（59%），17只为雌性（41%）。年龄中位数为10岁（范围：0.2–14岁），体重中位数为14公斤（范围：2.2–50.5公斤）。纳入研究的犬种包括混种犬（19只）、西施犬（4只）、西伯利亚哈士奇（3只）、吉娃娃（3只）、博美犬（3只）、美国斗牛犬（2只）和约克夏梗（2只）等。
讨论
我们评估了一种先前经过验证的诊断技术ddPCR在检测疑似CME的血清学阳性犬只中E. canis DNA的效果。研究结果表明，ddPCR的敏感性更高，可能是有价值的诊断工具，优于qPCR和cPCR。值得注意的是，没有ddPCR检测阴性的犬只被其他两种方法检测为阳性。EDTA处理的血液样本显示出最高的阳性率，并且作为分子检测的可靠临床样本...
作者贡献声明
Natthanet Sritrakoon：资源准备。Sarawan Kaewmongkol：数据可视化、软件使用、项目管理、方法论设计、数据分析。Krittanut Kanittakul：初稿撰写、资源获取、调查实施、数据分析。Peeravit Sumpavong：初稿撰写、资源协调、方法论设计、调查实施。Gunn Kaewmongkol：文章修订与编辑、数据可视化、验证工作、项目监督及资金筹措、概念构思。
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在撰写本文期间，作者使用了ChatGPT（OpenAI）和Grammarly Proofreader辅助英语编辑。使用这些工具/服务后，作者对内容进行了必要的审查和修改，并对发表文章的内容负全责。
资金支持
该项目由泰国国家研究委员会（NRCT）和卡塞萨特大学研究与发展研究所（KURDI）资助（项目编号：N42A650280）。该研究还获得了卡塞萨特大学研究生奖学金计划的资助。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢卡塞萨特大学兽医学院兽医技术系和兽医教学医院的所有工作人员在本研究中的支持。同时，我们也感谢Burin Nimsuphan教授和Pasinee Sakulchatwut博士提供的技术支持。
