靶向多KRAS突变体的非共价Pan-KRAS抑制剂BBO-11818的发现及其临床前评价

《Cancer Discovery》：BBO-11818 demonstrates dose- and time-dependent inhibition of pERK and stro... Open Access

【推荐语】KRASG12C抑制剂获批后，临床常见KRASG12D、KRASG12V等突变体仍缺乏靶向药物。本研究发现了一种新型口服、高选择性、非共价的pan-KRAS抑制剂BBO-11818。它能同时靶向KRAS-GDP（OFF）和KRAS-GTP（ON）状态，在细胞和动物模型中展现出对MAPK信号通路和肿瘤生长的强效抑制，并与免疫检查点抑制剂、抗EGFR抗体等联用显示出增强疗效，目前已进入I期临床试验，为多种KRAS突变癌症患者带来新希望。

　　

在人类癌症的复杂基因组图谱中，KRAS基因的突变犹如一个顽固的“开关”，长期处于“开启”状态，驱动着肿瘤细胞的疯狂生长与增殖。KRAS蛋白是一种小GTP酶，正常情况下在GDP结合的“关闭”(OFF)状态与GTP结合的“开启”(ON)状态间循环。当KRAS发生突变（如G12D、G12V、G12C），其GTP水解能力受损，导致蛋白持续处于激活的GTP结合状态，进而异常激活下游的MAPK和PI3K-AKT等关键信号通路，最终导致肿瘤发生。据统计，约30%的肺癌、40%的结直肠癌和高达90%的胰腺导管腺癌(PDAC)携带致癌性KRAS突变，使其成为最常被突变的癌基因之一。

尽管KRAS作为癌基因的重要地位早已确立，但针对它的药物研发却历经数十年坎坷，一度被认为是“不可成药”的靶点。这一困境在KRAS^G12C突变特异性共价抑制剂（如sotorasib和adagrasib）获批后才被打破。然而，KRAS^G12C突变仅在部分非小细胞肺癌(NSCLC)中常见，在结直肠癌和胰腺癌中更常见的则是KRAS^G12D和KRAS^G12V突变。目前，对于这些临床意义重大的KRAS突变体，仍缺乏获批的靶向疗法。此外，已报道的许多pan-KRAS抑制剂主要选择性靶向非活性的GDP结合状态（OFF状态），对GTP结合的活性状态（ON状态）抑制能力有限，这可能限制了其在体内的完全疗效。因此，开发一种能够同时有效抑制多种KRAS突变体（包括G12D和G12V）在ON和OFF两种状态的抑制剂，成为了肿瘤治疗领域一个亟待满足的巨大临床需求。

为了应对这一挑战，研究人员开展了一项开创性研究，致力于发现和表征一种新型的pan-KRAS抑制剂。这项研究最终成功鉴定出BBO-11818，一种强效、高选择性、具有口服生物利用度的非共价pan-KRAS抑制剂。相关研究成果已发表在顶尖肿瘤学期刊《Cancer Discovery》上。

本研究综合运用了结构生物学、生物化学、细胞生物学和体内药效学等多种关键技术方法。研究人员通过基于结构的药物设计，对先导化合物进行优化。利用表面等离子共振(SPR)和同质时间分辨荧光(HTRF)等生化 assay评估化合物与不同KRAS突变体的结合能力及对蛋白-蛋白相互作用(PPI)的抑制效果。通过X射线晶体学解析了BBO-11818与KRAS^G12D在GDP和GppNHp（一种不可水解的GTP类似物）结合状态下的复合物结构。在细胞水平，使用了包括55个癌细胞系的面板、基因工程鼠胚胎成纤维细胞(MEF)系以及Ba/F3细胞系，通过检测pERK（磷酸化ERK）和细胞活力来评估化合物的信号通路抑制活性和选择性。动物实验则采用了多种KRAS突变的人源肿瘤异种移植(CDX)模型、患者来源异种移植(PDX)模型以及小鼠同源肿瘤模型，进行药效学和药代动力学研究，并评估了BBO-11818与抗PD-1抗体、抗EGFR抗体（西妥昔单抗）以及RAS:PI3Kα breaker化合物BBO-10203的联合治疗效果。

研究结果

BBO-11818的发现：一种强效、选择性的KRAS双状态抑制剂

研究人员从之前报道的共价KRAS^G12C抑制剂BBO-8520出发，该化合物对非KRAS^G12C突变体也显示出一定的非共价结合活性。通过聚焦于喹唑啉核心的C4位点进行结构优化，他们首先得到了化合物2，其对GDP和GppNHp结合的多种KRAS突变体的结合力均有大幅提升。然而，化合物2的口服生物利用度较差。进一步的ADME（吸收、分布、代谢、排泄）性质优化，将2-甲基丙基酰胺替换为甲基氨基甲酸酯，最终得到了BBO-11818。SPR结合实验表明，BBO-11818能以纳摩尔级的高亲和力结合KRAS^G12D、KRAS^G12V和野生型KRAS(KRAS^WT)的ON和OFF两种状态，并且对KRAS的选择性比NRAS或HRAS高500倍以上。在HTRF assay中，BBO-11818能有效破坏RAF1-RBD与多种KRAS突变体（G12D, G12V, G12C, G12R）及KRAS^WT的相互作用，证明其功能活性。

晶体结构揭示BBO-11818结合ON和OFF状态KRAS^G12D的机制

为了阐明BBO-11818的作用模式，研究人员解析了其与GDP和GppNHp结合的KRAS^G12D的共晶结构，分辨率分别为1.70 ?和1.35 ?。在两个结构中，BBO-11818都结合在Switch-II和Helix 3之间的口袋，诱导Switch-I处于开放的构象，这与效应蛋白结合不相容。BBO-11818与蛋白之间形成了广泛的范德华力、氢键和盐桥相互作用。两个结构高度相似，解释了其能同时结合两种状态的分子基础。与共价抑制剂BBO-8520不同，BBO-11818C4位取代基中的甲基氨基甲酸酯与第12位残基的主链胺形成氢键，其吡咯烷基团则与各种G12突变体（C, V, R）的侧链有范德华力作用，这使其能广谱抑制不同的G12突变。

BBO-11818将KRAS锁定在无信号能力状态并抑制核苷酸交换

利用³¹P核磁共振(NMR)技术，研究人员发现BBO-11818结合能使KRAS^G12D-GTP从信号能力状态（state 2，γ2峰）向信号无能状态（state 1，γ1峰）转变，从而抑制其与下游效应蛋白的结合。此外，BBO-11818还能有效抑制鸟嘌呤核苷酸交换因子SOS介导的KRAS核苷酸交换，这种双重作用机制（诱导失活构象并阻断再激活）共同阻断了KRAS的信号传导。

BBO-11818在癌细胞中强效抑制MAPK信号通路和细胞活力

在涵盖55个癌细胞系的筛选中，BBO-11818能强效抑制KRAS突变细胞（包括G12D, G12V, G12C）中的pERK水平，半数有效浓度(EC₅₀)在0.356至28.1 nmol/L之间。在KRAS^AMP（KRAS基因扩增）细胞系中也有效，但在非KRAS驱动的细胞（NRAS或BRAF突变）中无效。在基因定义的MEF细胞中，BBO-11818能抑制KRAS突变和KRAS^WT的表达，但对NRAS、HRAS或BRAF^V600E驱动的信号无影响，证实了其对KRAS的高选择性。在Ba/F3细胞和88个癌细胞系的3D球体活力实验中，BBO-11818对多种KRAS突变驱动的细胞生长表现出强效抑制，特别是对G12D、G12V和G12C突变。值得注意的是，它对组成性GTP结合的KRAS^A59G突变体也有效，进一步证明其能抑制KRAS的ON状态。

BBO-11818可靶向细胞中KRAS突变体的ON状态

在生长因子EGF刺激实验和KRAS^G12D/A59G双突变细胞模型中，BBO-11818抑制MAPK信号的能力优于仅靶向OFF状态的KRAS抑制剂BI-2493，表明BBO-11818在细胞环境中确实具有靶向ON状态KRAS的能力