研究无菌水凝胶作为APOSECTM（一种用于治疗愈合不良伤口的应激外周血单核细胞分泌组）的局部递送载体

《International Journal of Pharmaceutics》：Investigation of sterile hydrogels as topical vehicles for APOSECTM, a stressed peripheral blood mononuclear cell secretome for the treatment of poorly healing wounds

　　达莉亚·哈米德（Dalia Hamid）、丽莎·奥尔（Lisa Auer）、斯特凡·莫尔（Stefan Mohr）、西尔维娅·加兹达-米亚雷卡（Sylwia Gazda-Miarecka）、梅兰妮·萨莱克（Melanie Salek）、汉内斯·库特赖伯（Hannes Kühtreiber）、尼娜·兰戈特-费林格（Nina Langoth-Fehringer）、坦雅·普莱格（Tanja Pfleger）、维多利亚·克兰格（Victoria Klang）、迈克尔·米尔德纳（Michael Mildner）、克莱门斯·艾格纳（Clemens Aigner）、迪克·索尔根弗雷（Dirk Sorgenfrey）、亨德里克·扬·安克斯米特（Hendrik Jan Ankersmit）、莉亚·安·戴利（Lea Ann Dailey）、吉安卢卡·贝洛（Gianluca Bello）

维也纳大学药学系，约瑟夫-霍劳贝克广场2号，1090维也纳，奥地利

摘要

APOSECTM是一种由应激状态的外周血单核细胞分泌的蛋白质、脂质和外泌体组成的复杂混合物，目前正处于临床试验阶段，用于治疗慢性伤口。在应用于开放性伤口时，1毫升的APOSECTM冻干粉需要与3克无菌水凝胶混合后使用。本研究探讨了这种新型给药系统的药学性能。研究人员开发了一种凝胶制剂（APOgel），可在预填充的注射器中进行最终灭菌处理，其灭菌后的粘度（约325–350 Pa·s/s）与商业基准凝胶相当。将APOgel与液体APOSECTM替代品按3:1的比例混合后，粘度降低了约67%，并且不同操作者之间的重复性很高（变异系数<6%）。从注射器中连续给予三个剂量的混合物显示，第一个和最后一个剂量的活性成分含量比中间剂量高约20%，这表明在封闭的注射器系统中混合不均匀。体外释放研究表明，与基准凝胶相比，无菌APOgel中小分子标记物和总蛋白质的释放量分别高出32%和48%，而72小时内的总释放量分别为APOgel系统的100%和25%。在小鼠伤口愈合模型中的疗效研究未发现APOgel与基准凝胶之间存在显著差异。总体而言，APOgel作为一种凝胶平台具有局部给药的潜力，但其混合系统、释放动力学和测试方法需要在更广泛使用前进一步优化。

引言

慢性不愈合伤口是糖尿病最常见的并发症之一，显著增加了截肢和早死的风险（Monaghan等人，2023年）。这些溃疡的病理生理机制是多因素的，涉及血管生成受损、内皮细胞过度凋亡以及伤口愈合过程功能障碍（Deng等人，2023年）。从基于细胞的方法到无细胞分泌组、皮肤替代物和基因治疗等先进的治疗方法，在治疗此类慢性不愈合伤口方面显示出希望（Monaghan等人，2023年；Deng等人，2023年）。在开发中的疗法中，无细胞的应激状态外周血单核细胞（PBMC）分泌组（APOSECTM）在大小动物伤口模型中显示出有希望的组织再生活性（Hacker等人，2016年；Wagner等人，2018年）。APOSECTM促进伤口愈合的机制已在体外和体内系统中进行了研究（Beer等人，2016年）。Beer等人（2015年）首次证明APOSECTM的生物活性与其所含多种分泌蛋白、脂质和外泌体的存在相关。研究表明，在培养基中培养之前，用60 Gy的辐射（无论是放射性核素还是直线加速器）处理PBMC对APOSECTM的活性是必不可少的（Hacker等人，2016年；Beer等人，2015年；Laggner等人，2021年）。生物信息学分析显示，由应激PBMC释放的蛋白质编码基因是再生途径的介质。除了蛋白质外，其他关键成分还包括micro-RNA（miRNA），它们影响细胞通讯和再生过程（Beer等人，2015年；Beer等人，2014年）。有证据表明，伤口愈合效果主要归因于体外和体内的血管生成和上皮细胞增殖的启动。

APOSECTM是在良好生产规范（GMP）条件下生产的，通过γ-辐射（60 Gy）处理从供体血液中提取的PBMC，随后在专有培养基（如AM2培养基）中进一步培养。去除PBMC后，剩余的液体部分（含有可溶性因子和介质，即被丢弃的PBMC的分泌组）经过两次正交病毒清除步骤，最终进行冻干（图S1；补充信息部分）。在这个独特过程中，培养基成为药品的一个组成部分。需要注意的是，无细胞的APOSECTM按定义是一种生物药品（即基于培养的产品；指令2001/83/EC），而不是先进治疗药品（ATMP）、基因治疗药品、体细胞治疗药品或组织工程产品（法规EC No 1394/2007）。

经过验证的生物测定表明，APOSECTM可以生产出批次间一致性和长期货架稳定性的产品（Laggner等人，2020年；Wuschko等人，2019年；Gugerell等人，2020年）。该产品于2017年成功完成了使用自体APOSECTM的I期试验。2023年，一项关于使用同种异体APOSECTM治疗糖尿病足溃疡的安全性和临床疗效的I/II期研究已完成（Simader等人，2017年；MARSYAS II临床研究报告摘要，xxxx）。在MARSYAS I/II研究期间，APOSECTM的合同制造商（BSZ Linz）将冻干粉（APOSECTM：用于皮肤应用的水溶液或安慰剂：经过所有APOSECTM生产步骤的培养基）重新配制到20R小瓶中，每0.5毫升含有100 U APOSECTM（或安慰剂）。APOSECTM/安慰剂浓缩液被冷冻并储存在-20°C。分销商（ABF）将标记的小瓶连同冷冻浓缩液发送到临床研究地点，在那里产品储存在符合GCP要求的（受监控的）冷冻柜中，直到招募到糖尿病足溃疡患者并将其分配到随机组。为了准备“即用型”APOSECTM产品，医院药房工作人员解冻适当数量的小瓶，并将浓缩液用0.9% NaCl稀释至12.5U/mL、25U/mL或50U/mL（反映研究中的不同剂量水平），然后抽取1毫升注入注射器。安慰剂浓缩液也以类似方式制备。第二支注射器手动填充3毫升NU-GEL水凝胶（Systagenix，英国西萨塞克斯郡加特威克），这是一种用于局部给药的无菌藻酸盐基凝胶（表1）。使用Luer连接器（Combifix?适配器）将两支注射器连接起来，将液体浓缩液与凝胶混合，并收集在单个量筒中（总共4毫升）。在护理点，根据测量的伤口直径（0.5 mL/cm2），将APOSECTM/NU-Gel或安慰剂/NU-Gel的混合液按6.25 U/cm2、12.5 U/cm2或25 U/cm2的剂量施加到伤口上（图S2，支持信息部分）。此过程每72小时重复一次。

试验过程中的经验指出了两个可以改进的给药系统方面。首先，将无菌凝胶预先填充到注射器中会更有利，从而避免手动填充的需要，减少准备时间和微生物污染的风险。其次，增加每单位产品中的APOSECTM和凝胶的量可以使临床医生根据伤口大小灵活地给予1、2或3毫升的剂量（即从单剂量系统过渡到多剂量分配系统）。设计了一项研究来探讨结合这两个原则的假想系统的药学性能。在研究的第一部分，我们开发了一种与基准产品Nu-Gel成分相似的水凝胶，可以预先填充到可高压灭菌的环烯烃聚合物（COP）注射器（3克）中，并进行最终灭菌（图1A）。理想情况下，高压灭菌后的凝胶流变性能应与Nu-Gel相当（约350 Pa·s/s），且不应观察到可检测到的降解产物。

在研究的第二部分，研究了注射器混合和多剂量分配系统的药学性能。设想的制备程序包括：1）将冻干APOSECTM粉末重新配制到1毫升无菌盐水中；2）将液体吸入无菌量筒；3）使用Luer连接器（Combifix?适配器）将装有液体的注射器与含有3克无菌APOgel的COP注射器连接；4）在两个注射器之间来回传递液体20次以混合液体和凝胶；5）将混合物收集在量筒中；6）将规定体积的混合物施用于伤口。这种分配系统的性能不仅在APOSECTM的开发背景下具有兴趣，也为相关的药物递送策略提供了重要见解，特别是在基于细胞外囊泡（EV）的治疗领域。例如，越来越多的研究正在探讨将治疗性EV与凝胶形成赋形剂共同配制，用于注射后在组织工程或眼部药物递送中的局部靶向递送（Ma等人，2024年；Hwang和Lee，2024年；Zhang等人，2025年；Fu等人，2025年）。

材料

药用级别的羧甲基纤维素钠盐（Ph. eur.，NaCMC）、羟乙基纤维素250HX 10,000 mPa·s Ph. Eur.（HEC）、丙二醇（PPG，Ph. Eur. 11.0）和海藻酸钠（Ph. Eur. 11.0，NaAlg）从Gatt-Koller（奥地利Absam）购买。APOgel中的氯化钠（Ph.Eur.）来自Fagron GmbH（德国格林德）。氯化钠（NaCl，纯度≥99%）和酪蛋白大豆消化物（CASO）由Carl Roth（德国卡尔斯鲁厄）提供。

APOGel的表征

半成品药物产品（用于局部涂抹开放性伤口）的质量要求（Troiano等人，2016年；Dailey，2018年）基于欧洲药品局的指导（欧洲药品局关于局部应用的局部作用皮肤产品的质量和等效性指南，xxxx），并增加了无菌性的规定，因为该产品将应用于开放性伤口。预填充注射器中无菌APOgel的关键质量属性（CQAs）列在表中。

结论

本研究评估了APOgel作为一种可高压灭菌的水凝胶，作为生物产品的局部给药基质，以APOSECTM为例系统。该配方满足了几个预定义的CQAs，包括无菌性、pH值和化学稳定性，尽管灭菌后的粘度略低于基准产品Nu-Gel。通过注射器连接器混合导致凝胶中的浓度不均匀，这可能限制了单独分配时的均匀性。

未引用的参考文献：Coderch等人，2021年；Xu等人，2025年。

作者贡献声明

达莉亚·哈米德（Dalia Hamid）：撰写——原始草稿、可视化、验证、调查、形式分析、数据管理。丽莎·奥尔（Lisa Auer）：撰写——原始草稿、可视化、方法学、调查、形式分析、数据管理。斯特凡·莫尔（Stefan Mohr）：资源、方法学。西尔维娅·加兹达-米亚雷卡（Sylwia Gazda-Miarecka）：数据管理。梅兰妮·萨莱克（Melanie Salek）：调查、概念化。汉内斯·库特赖伯（Hannes Kühtreiber）：验证、调查、概念化。尼娜·兰戈特-费林格（Nina Langoth-Fehringer）：验证、项目管理、概念化。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：吉安卢卡·贝洛（Gianluca Bello）报告称设备、药品或供应品由Aposcience AG提供。亨德里克·扬·安克斯米特（Hendrick Jan Ankersmit）报告与Aposcience AG的关系，包括董事会成员资格。H.J. Ankersmit拥有由APOSCIENCE AG颁发的专利#EP2201954。亨德里克·扬·安克斯米特（Hendrick Jan Ankersmit）、迈克尔·米尔德纳（Michael Mildner）和西尔维娅·加兹达-米亚雷卡（Sylwia Gazda-Miarecka）分别担任首席执行官、首席科学官和质量总监。

致谢

我们感谢维也纳大学和维也纳医科大学的同事们的宝贵贡献。同时，我们也感谢格拉茨LKH-大学医院的同事们的支持以及提供设施的使用权限。我们感谢CRISCAR Familienstiftung的H.P. Haselsteiner博士和Karl Fister对这一私人-公共合作伙伴关系的信任，该合作旨在加强维也纳医科大学和维也纳大学的基础和转化临床研究。