基于三维（3D）培养人脐带间充质干细胞（HucMSCs）来源细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）通过递送BECN1增强宫腔粘连（Intrauterine Adhesions, IUA）治疗疗效的研究

《Materials Today Bio》：3D HucMSCs derived extracellular vesicles enhanced therapeutic efficacy in treating intrauterine adhesions via BECN1 delivery

　　

摘要：宫腔粘连（Intrauterine Adhesions, IUA）是女性不孕的重要原因，也是育龄期女性重大公共卫生问题。已有证据表明间充质干细胞来源细胞外囊泡（Mesenchymal Stem Cell-derived Extracellular Vesicles, MSC-EVs）在IUA治疗中具有潜力，但传统二维（Two-Dimensional, 2D）培养体系限制了EVs的产量与生物活性。本研究采用基于甲基丙烯酸明胶（Gelatin Methacryloyl, GelMA）微球的3D培养平台培养人脐带间充质干细胞（Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells, HucMSCs）并分离MSC-EVs。对比分析显示，与2D-EVs相比，3D-EVs在体外能显著更优地恢复米非司酮（Mifepristone, Mif）损伤的人子宫内膜基质细胞（human Endometrial Stromal Cells, hESCs）的增殖、迁移、活力并减轻纤维化。在IUA动物模型中，负载3D-EVs的GelMA水凝胶原位治疗显示出卓越的再生能力：有效恢复子宫内膜黏膜厚度及腺体密度、改善子宫内膜纤维化并最终改善生殖结局。蛋白质组学分析及功能验证实验表明，3D-EVs中自噬相关蛋白BECN1（Beclin?1）表达上调是3D-EVs对损伤hESCs增强治疗作用的重要贡献因素。本研究确立了3D培养来源EVs作为治疗IUA的创新无细胞治疗策略，既克服了传统EVs制备方法的局限，也满足了IUA有效治疗的临床需求，为靶向子宫内膜病变的先进再生策略奠定了基础。

论文解读：

本研究发表于《Materials Today Bio》。宫腔粘连（Intrauterine Adhesions, IUA）是子宫内膜损伤后纤维组织增生和粘连所致的疾病，常引起闭经、月经量减少、不孕、复发性流产及胎盘异常植入，其根本病理机制为子宫内膜基底层功能性干细胞耗竭导致修复障碍，促进纤维化。当前临床采用宫腔镜下粘连分离术（Transcervical Resection of Adhesions, TCRA）联合术后雌激素及宫内物理屏障治疗，但复发率高且无法恢复子宫内膜再生能力。间充质干细胞来源细胞外囊泡（Mesenchymal Stem Cell-derived Extracellular Vesicles, MSC-EVs）作为无细胞治疗载体可传递mRNA、microRNA、脂质和蛋白质调控受体细胞功能，且无致瘤、低免疫原性优势，但传统二维（Two-Dimensional, 2D）平面培养所获EVs产量低、生物功能不稳定，体内快速清除及缺乏靶向性也限制其应用。三维（Three-Dimensional, 3D）培养可更好模拟体内微环境、维持干细胞干性并提高EVs产量与改变 cargo组成。基于此，研究人员假设采用GelMA（Gelatin Methacryloyl，甲基丙烯酸明胶）微球3D培养人脐带间充质干细胞（Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells, HucMSCs）所分泌的EVs较2D-EVs含有更高水平抗纤维化相关 cargo，包裹于光交联GelMA水凝胶中实现原位缓释，可在IUA小鼠模型中获得更优子宫内膜修复及生育力恢复效果，并探究关键分子机制。

主要关键技术方法：研究人员从健康剖宫产产妇脐带Wharton's Jelly分离培养HucMSCs并经形态、表面标志物（CD73?CD90?CD105?CD45?）及三系分化鉴定；采用GelMA微球（GelMA Microspheres, GMs）进行HucMSCs的3D培养与2D培养对照，分别收集上清差速超离获取3D-EVs与2D-EVs并做透射电镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）、纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）及Western blot（CD81、TSG101、CD63阳性，钙连蛋白Calnexin阴性）鉴定；将EVs混入含光引发剂锂酰基膦酸盐（Lithium Acylphosphinate）的GelMA溶液紫外光交联制备EVs负载GelMA水凝胶（EVs@GelMA），评估孔隙结构、体外释放曲线及小鼠子宫内滞留时间（DiR荧光标记活体成像）；建立米非司酮（Mifepristone, Mif, 60 μmol/L, 48 h）损伤的hESCs体外模型，以不同浓度2D/3D-EVs干预，检测细胞活力（CCK?8、Live/Dead染色）、迁移（Transwell、划痕）、增殖（EdU）、凋亡（Annexin V?FITC/7?AAD流式）、纤维化标志（免疫荧光Collagen I、Western blot检测E?cadherin/E?cad、COL1A1、TGF?β、α?SMA）；构建C57BL/6雌鼠机械刮宫+80%乙醇灌注IUA模型，伤后7 d于损伤部位原位植入PBS、单纯GelMA、2D?EVs@GelMA或3D?EVs@GelMA（各含1×101? particles EVs），术后14 d取子宫行HE、Masson三色、免疫荧光及Western blot评估内膜厚度、腺体数、胶原沉积与纤维化标志，另一部分雌鼠于治疗后3个动情周期与雄鼠合笼评估胚胎着床数、胎仔数与活产率；对Mif损伤hESCs经PBS、2D?EVs、3D?EVs处理后行转录组测序（RNA?seq），对2D?EVs与3D?EVs行非标记定量蛋白质组学（Label?free LC?MS/MS）分析差异蛋白；用慢病毒shRNA敲低HucMSCs中BECN1（Beclin?1）基因获得BECN1低表达3D?EVs（3D?EVs^sh?Beclin1），验证敲低效率及EVs表征后用于hESCs抗纤维化功能回补实验。

研究结果如下：

3.1. Isolation and identification of HucMSCs：原代培养HucMSCs呈成纤维样梭形，高表达CD73、CD90、CD105，低表达CD45，且具备成骨、成脂、成软骨三向分化能力，符合MSC鉴定标准。

3.2. Isolation and characterization of 2D-EVs and 3D-EVs：GMs表面HucMSCs贴附良好且活率高；TEM下2D?EVs与3D?EVs均呈典型杯状形态，NTA示粒径分别约135.2±55.8 nm与127.6±63.3 nm，Western blot确认EVs标志物阳性而Calnexin阴性；3D培养每细胞EVs产量约为2D的2倍，蛋白含量提高约50%。

3.3. 3D-EVs protect against Mif-induced injury of hESCs：Mif损伤hESCs后，2D?EVs与3D?EVs均可浓度依赖性恢复细胞活力，最适浓度为1×10? particles/mL；3D?EVs从第4天起细胞活力、活细胞比例显著高于2D?EVs；PKH26标记证实hESCs可内化EVs；3D?EVs较2D?EVs更显著促进Transwell与划痕迁移距离、提高EdU?增殖率、降低凋亡率，并更显著降低Collagen I免疫荧光强度及下调COL1A1、TGF?β、α?SMA且上调E?cad，表明3D?EVs在体外对损伤hESCs具更优促增殖、迁移、抗凋亡及抗纤维化作用。

3.4. Characterization of EVs@GelMA hydrogels：EVs均匀分散于GelMA基质，掺入不影响水凝胶孔径（~100 μm）与孔隙率（~50%），FTIR未见新化学键形成；体外PKH26?EVs@GelMA处理hESCs显示更高内化率及缓释特征，BCA法示9 d持续释放、10 d累积释放约80%、前2 d突释约20%；DiR标记活体成像示EVs@GelMA在小鼠子宫内滞留至14 d仍有约10%信号，游离EVs组7 d即清除，证实GelMA可实现EVs原位缓释与延长滞留。

3.5. 3D-EVs@GelMA present better therapeutic capacity in endometrial injury than 2D-EVs@GelMA in vivo：IUA模型伤后7 d治疗，14 d后Sham组子宫结构正常，IUA组宫腔扩张、腺体缺失、内膜变薄伴广泛胶原沉积；2D?EVs@GelMA与3D?EVs@GelMA均改善上述病理，3D?EVs@GelMA使内膜厚度较IUA组增加2.4倍、腺体密度恢复至Sham组80%，Masson示胶原面积较IUA组减少58%，免疫荧光与Western blot示COL1A1与α?SMA显著降低、E?cad升高且优于2D?EVs@GelMA组，证明3D?EVs包载GelMA原位治疗在动物体内具更优子宫内膜修复与抗纤维化效能。

3.6. 3D-EVs@GelMA recovers fertility attenuated by endometrial injury：合笼实验显示IUA组胚胎着床数与活产数显著低于Sham，2D?EVs@GelMA与3D?EVs@GelMA均提升，其中3D?EVs@GelMA组胚胎着床数、胎儿数与活产率最高，子代出生第1天与第14天体质量在各组间无差异，表明治疗恢复生育力且对子代发育无不良影响。

3.7. Transcriptome sequencing：RNA?seq显示3D?EVs处理使Mif诱导的差异表达基因恢复，KEGG富集于上皮?间质转化（Epithelial?Mesenchymal Transition, EMT）、mTORC1、炎症及TGF?β通路；GSEA示3D?EVs显著下调EMT相关基因集，RT?qPCR验证TGFβ1与IGFBP5下调，提示3D?EVs可能通过抑制EMT减轻纤维化。

3.8. 3D-EVs May deliver BECN1 to inhibit fibrosis and accelerate endometrial repair：蛋白质组学分得127个显著差异蛋白，3D?EVs中自噬起始蛋白BECN1（Beclin?1）表达较2D?EVs上调约3倍；ELISA与Western blot验证此差异；3D?EVs处理的损伤hESCs中BECN1蛋白水平较2D?EVs处理组更高，提示3D?EVs通过递送高水平BECN1发挥部分治疗作用。

3.9. Inhibition of BECN1 partly abolished the therapeutic effects of 3D-sEVs in the reversal of IUA fibrosis：shRNA敲低HucMSCs中BECN1获得低BECN1含量的3D?EVs^sh?Beclin1，其形态尺寸浓度及EVs标志物同对照；用3D?EVs^sh?Beclin1处理Mif损伤hESCs，Collagen I下调幅度减弱，COL1A1、TGF?β、α?SMA下调被削弱，E?cad上调被削弱，证明BECN1是3D?EVs抗纤维化效应的重要介导因子。

讨论部分总结：研究人员指出IUA传统疗法无法逆转纤维化，MSC?EVs是前景广阔的无细胞疗法但受限于2D培养EVs缺陷；3D培养尤其是GMs支架可更好模拟微环境、维持MSC干性并提高EVs产量与质量，本研究中3D?EVs产量加倍且在体外体内均优于2D?EVs；GelMA水凝胶单独有一定屏障、抗炎及仿ECM支持作用，但与EVs联用协同增效；单纯GelMA有轻微治疗效果但不及EVs联合组；蛋白质组发现3D?EVs富集BECN1，BECN1敲低削弱抗纤维化效果，说明BECN1递送是3D?EVs优势机制之一，且EVs整体疗效应为多 cargo协同；转录组提示3D?EVs抑制EMT且富集TGF?β通路，自噬激活（BECN1介导）可能通过促进Snail/Twist降解抑制EMT从而减轻纤维化，但具体机制尚需验证；研究局限包括未阐明3D培养上调BECN1并装载入EVs的具体调控通路、未涉及血管新生与免疫调节、未进行长期安全性与大动物剂量优化。

结论部分翻译：本研究证明，与常规2D培养来源EVs相比，GMs 3D培养的HucMSCs来源EVs在减轻Mif诱导hESCs损伤及机械损伤IUA小鼠模型中具有更优治疗功效，该治疗效应部分由3D?EVs向损伤细胞递送上调的BECN1（Beclin?1）所介导。总之，本研究为靶向IUA的非激素类子宫内膜修复策略开辟了新途径，具有重要临床转化潜力。