基于Cas12a2的多路复用丝网印刷电极电化学发光生物传感器，用于无需扩增即可检测气溶胶中的SARS-CoV-2

《Biosensors and Bioelectronics》：Cas12a2-based Multiplexed Screen-Printed Electrode Electrochemiluminescence Biosensor for Amplification-Free SARS-CoV-2 Detection in Aerosols

　　

范泽|尹晓云|马明浩|杜斌|刘志伟|徐继伟|刘冰|童朝阳

中国北京102205，国家关键实验室（NBC危害防护化学实验室）

摘要

呼吸道病毒的空气传播对公共卫生构成了严重威胁，迫切需要便携且灵敏的病毒气溶胶监测技术。CRISPR-Cas12技术为核酸检测领域带来了诸多创新。其中，Cas12a2具有独特的RNA触发切割活性，在无需扩增的情况下检测呼吸道RNA病毒方面表现出显著优势。本文基于丝印电极，结合Cas12a2的特异性识别能力和多种crRNA的协同激活效应，开发了一种无需扩增且无需电极改性的电化学发光生物传感平台。优化的Cas12a2系统能够实现SARS-CoV-2 RNA的超灵敏检测，最低检测限为76 aM。此外，我们还构建了一种稳定的病毒气溶胶生成与收集装置，并成功验证了该平台在SARS-CoV-2气溶胶检测中的实际应用能力。这种快速、便携的检测策略为现场监测空气中的病原体提供了有前景的替代方案，进一步扩展了CRISPR生物传感技术在病毒检测中的应用范围。

引言

呼吸道病毒的气溶胶传播是导致大规模流行的关键途径。直径小于5 μm的病毒气溶胶颗粒可在空气中悬浮数小时，从而实现远距离传播，显著增加人群暴露的风险[1]、[2]、[3]。当前的流行病预防和控制系统缺乏实时监测空气中的病毒的能力，使得疫情预警变得困难（图1A）。准确捕获和量化气溶胶中的病毒是中断传播链和评估公共场所风险水平的关键步骤[4]、[5]。

CRISPR-Cas系统的出现为分子诊断领域带来了创新[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。新型的Cas12a2核酸酶是CRISPR-Cas系统中的突破性功能蛋白[13]。与传统针对DNA的Cas12a蛋白不同，Cas12a2通过目标RNA序列特异性激活。一旦被激活，Cas12a2会表现出强效且广谱的切割活性，非特异性地降解单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）和RNA底物[14]、[15]。此外，其快速的酶促反应动力学使得在短时间内实现高效信号放大成为可能，为无需扩增的核酸检测提供了新的技术平台。由于这些特性，Cas12a2在灵敏、低成本的即时检测中具有巨大潜力，特别是在快速检测呼吸道RNA病毒方面。目前关于Cas12a2的研究仍处于早期阶段，其在核酸检测中的应用探索有限，其在气溶胶中检测病毒的应用尚未有报道，这为技术创新和研究价值提供了重要机会。

电化学发光（ECL）检测技术具有独特的优势，因为激发源（电信号）和输出信号（光信号）完全分离，具有很强的抗干扰能力和高信噪比，能有效避免复杂环境样本的干扰，非常适合检测气溶胶样本中的低丰度目标[16]、[17]、[18]、[19]、[20]。传统的ECL检测系统依赖于大型电解池，存在操作复杂和难以微型化等缺点，限制了其在即时检测中的应用。相比之下，丝印电极（SPE）将工作电极、对电极和参比电极集成在一个微型芯片上，具有低成本、高便携性和大规模生产能力，为将ECL技术应用于便携式即时检测提供了关键桥梁，是构建快速现场检测系统的理想平台[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。

在本研究中，我们创新性地开发了一种基于Cas12a2的丝印电极电化学发光系统（Cas12a2-SPE-ECL），并设计了一种ECL报告分子：一种5’端标记钌复合物、3’端标记生物素的单链DNA（Ru(bpy)₃²⁺-ssDNA-Biotin）。该分子作为Cas12a2切割活性的通用单链DNA底物。钌复合物有效参与ECL反应，而生物素通过链霉亲和素修饰的磁珠（SA-MB）实现特异性捕获和高效富集。激活后，Cas12a2切割ECL报告分子，3’-生物素化片段被磁珠捕获，5’-钌标记片段留在上清液中。然后将上清液滴在SPE表面，使用便携式ECL设备灵敏地检测生物信号。基于这一设计，我们在CRISPR-Cas12a2介导的生物识别事件与ECL信号生成之间建立了稳定高效的信号转导，无需电极表面修饰，大大简化了操作流程。

此外，我们设计了多种针对SARS-CoV-2 RNA保守区域的crRNA。通过这些crRNA的协同作用，实现了无需扩增的超灵敏SARS-CoV-2检测，最低检测限为76 aM（无需扩增特指核酸检测步骤）。我们还构建了一种稳定的病毒气溶胶生成与收集系统，并使用Cas12a2-SPE-ECL系统成功检测到了SARS-CoV-2病毒气溶胶。多crRNA协同检测与ECL检测方法的结合有效弥补了无需扩增方法通常导致的灵敏度损失（图1B）。总之，本研究提出的检测策略为病毒气溶胶的灵敏检测提供了新方法，扩展了CRISPR技术和ECL技术的应用范围。

章节摘录

Cas12a2-SPE-ECL系统

为了构建Cas12a2-SPE-ECL系统，反应系统中的信号报告分子被替换为ECL报告分子Ru(bpy)₃²⁺-ssDNA-Biotin。所有反应在总体积20 μL中进行，包括1×反应缓冲液、10 nM Cas12a2、10 nM crRNA、50 nM ECL报告探针以及不同浓度的2 μL RNA目标。反应混合物转移到Eppendorf PCR仪器中，在37 °C下孵育30分钟，以完成充分的切割反应。

Cas12a2的酶学特性

Cas12a2的特异性激活机制依赖于crRNA与目标RNA之间的互补碱基配对，以及目标RNA下游立即位置的特定间隔序列（PFS，5’-GAAAG-3’）的识别。这一特性为实现高度特异性的目标RNA检测提供了分子基础（图S1）。为了评估该机制在病毒RNA检测中的适用性，我们首先验证了PFS依赖的激活特性

结论

在本研究中，我们开发了一种基于Cas12a2的丝印电极电化学发光生物传感平台，用于SARS-CoV-2 RNA检测，并将其应用于病毒气溶胶。通过结合RNA激活的Cas12a2切割作用和基于SPE的ECL读出，该系统实现了无需核酸扩增或电极表面修饰的灵敏检测。多crRNA协同策略进一步提高了检测灵敏度，使得

CRediT作者贡献声明

尹晓云：方法学、形式分析。范泽：撰写——初稿、形式分析、数据管理、概念构思。童朝阳：撰写——审稿与编辑、监督、调查、形式分析、概念构思。刘冰：撰写——审稿与编辑、可视化、形式分析。杜斌：可视化、形式分析。马明浩：可视化、形式分析。徐继伟：可视化、形式分析。刘志伟：可视化、形式分析

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：42505136）的青年科学家基金（C类）和NBC危害防护国家关键实验室的独立研究项目（编号：SKLNBC20250111）的支持。