《European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases》：Evaluation of resistance mechanisms and susceptibility testing in Enterococcus spp.: implications of vancomycin-variable isolates and optrA-mediated resistance
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目的：万古霉素耐药肠球菌（VRE）因治疗选择有限及最后防线药物耐药性的出现，在医院环境中构成重大挑战。准确检测耐药机制并了解 circulating 菌株的分子流行病学对于有效的监测和控制感染至关重要。方法：分析了2018年至2022年间从临床标本中分离的19
目的：万古霉素耐药肠球菌（VRE）因治疗选择有限及最后防线药物耐药性的出现，在医院环境中构成重大挑战。准确检测耐药机制并了解 circulating 菌株的分子流行病学对于有效的监测和控制感染至关重要。方法：分析了2018年至2022年间从临床标本中分离的192株非重复肠球菌（103株VRE和89株万古霉素敏感株）。以肉汤微量稀释法（BMD）作为参考方法进行了抗菌药物敏感性试验，并与自动及梯度法进行比较。通过内部聚合酶链反应（PCR）和测序调查了与万古霉素和利奈唑胺耐药相关的耐药基因。采用任意引物聚合酶链反应（AP-PCR）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点序列分型（MLST）评估VRE菌株的克隆相关性。结果：在VRE分离株中，vanA是主要的耐药决定因子，而单株分离株携带vanB。重要的是，在表型上对万古霉素敏感的粪肠球菌（E. faecalis）分离株中也检测到vanA，这与万古霉素变异肠球菌一致。在3株分离株（1.6%）中鉴定出利奈唑胺耐药；两株E. faecalis分离株携带可转移的optrA基因，这是首次在土耳其报道导致人类感染的optrA阳性E. faecalis，而一株屎肠球菌（E. faecium）分离株在缺乏所调查耐药基因的情况下表现出利奈唑胺耐药。替加环素耐药不常见。达托霉素保留了体外活性，但在E. faecium中MIC??/MIC??值较高，而oritavancin的MIC值在E. faecalis分离株中较高。BD Phoenix系统在万古霉素和替考拉宁方面与BMD表现出高的分类一致性，但对利奈唑胺敏感性测试产生了主要错误和非常主要错误。分子分型显示VRE分离株之间具有广泛的遗传多样性，包括35种AP-PCR基因型、经PFGE确认的聚类（包括一种优势克隆）以及11种新型MLST序列型（ST2994–ST3004）的鉴定。结论：本研究为临床肠球菌分离株的耐药景观和遗传多样性提供了见解。万古霉素变异肠球菌和可转移利奈唑胺耐药决定因子的检测强调了整合表型和分子方法以确保准确耐药检测和有效监测的必要性。
肠球菌属细菌，特别是粪肠球菌（E. faecalis）和屎肠球菌（E. faecium），是医院获得性感染（包括心内膜炎、败血症、尿路感染和伤口感染）的主要致病菌之一。这些微生物表现出对头孢菌素、磺胺类、大环内酯类等多种抗菌药物类的内在耐药性，并通过基因组可塑性容易获得临床常用抗菌药物的耐药 determinant。随着万古霉素等广谱抗生素的大量使用，万古霉素耐药肠球菌（VRE）尤其是VREfm在2024年世界卫生组织（WHO）细菌优先病原体名单中被列为高优先级病原体，突显了有效治疗选择的局限性。欧盟疾病预防与控制中心（ECDC）的报告指出，VREfm在欧洲的流行率呈上升趋势。此外，万古霉素变异肠球菌（VVE）虽携带vanA基因但表型敏感，可能具有治疗期间回复高水平耐药的风险，增加了常规实验室检测的挑战。利奈唑胺作为治疗VRE的最后防线药物之一，其耐药性日益报告，主要由23S rRNA基因突变或optrA、cfr等移动遗传元件介导。达托霉素和替加环素虽具体外活性，但耐药性和检测标准化问题限制了其应用。多重耐药最后防线药物的同时出现严重限制了治疗选择，凸显了准确耐药检测的迫切需求。
研究人员针对这一背景，开展了一项研究，旨在表征来自临床样本的万古霉素耐药和敏感肠球菌分离株的抗菌药物敏感性谱和耐药基因型，评估各种抗菌药物敏感性试验（AST）方法与参考肉汤微量稀释法（BMD）相比的性能，并通过分子分型探索耐药分离株的遗传相关性。研究对象为2018年1月至2022年12月期间土耳其安卡拉 Hacettepe 大学医院中央细菌学实验室从临床标本中分离的192株非重复肠球菌（103株VRE和89株随机选择的万古霉素敏感株）。主要关键技术方法包括：利用自动 AST 系统 BD Phoenix 进行药敏筛查；采用 ISO 20776-1 标准的肉汤微量稀释法（BMD）作为参考方法测定最小抑菌浓度（MIC）；使用内部设计的聚合酶链反应（PCR）引物检测 vanA、vanB、optrA、cfr 和 poxtA 等耐药基因，并对阳性产物进行 Sanger 测序确认；采用任意引物聚合酶链反应（AP-PCR）进行初步分子分型，结合脉冲场凝胶电泳（PFGE）确认克隆相关性，并对代表性分离株进行多位点序列分型（MLST）以鉴定序列型（ST）。
研究结果主要涵盖以下几个方面：
1. 抗菌药物敏感性特征
研究人员通过BMD方法分析了耐药谱。结果显示，所有VRE分离株均对替考拉宁耐药并携带vanA基因，仅单株携带vanB。值得注意的是，3株（3.3%）表型对万古霉素敏感的肠球菌中检出了vanA基因，且均为粪肠球菌，符合万古霉素变异肠球菌（VVE）特征。利奈唑胺耐药率为1.6%，其中两株E. faecalis携带可转移的optrA基因，这是土耳其首次报道导致人类感染的optrA阳性E. faecalis；另一株E. faecium在缺乏所测耐药基因的情况下表现出耐药。替加环素耐药率低（2.1%）。达托霉素在E. faecium中的MIC??/MIC??值显著高于E. faecalis，而oritavancin在E. faecalis中的值更高。
2. 药敏试验方法性能评估
研究人员比较了BD Phoenix自动系统、梯度测试（ETest）和纸片扩散法与BMD参考方法的一致性。BD Phoenix系统在万古霉素和替考拉宁方面与BMD具有高度分类一致性（分别为98.4%和100%），但在利奈唑胺测试中出现了主要错误（ME）和非常主要错误（VME）。梯度测试在万古霉素和替考拉宁方面表现完美（100%和98.1%），但在利奈唑胺方面一致性较低（83.3%）。
3. 分子分型与遗传多样性
分子分型揭示了VRE分离株之间广泛的遗传多样性。AP-PCR鉴定出35种不同的基因型，PFGE证实了聚类模式，包括一种包含23株分离株的优势克隆。MLST分析鉴定出1种已知序列型（ST1661）和11种新型序列型（ST2994–ST3004）， deposited 在PubMLST数据库中。ST2996、ST3002和ST2997由多个分离株代表，显示了医院环境中克隆的传播。
讨论部分指出，vanA介导的高水平万古霉素和替考拉宁耐药是本研究的主要发现，与既往研究一致。VVE的存在突显了仅依赖表型测试的局限性，强调了在监测和暴发情况下进行分子筛选的重要性，以防止糖肽类耐药在医院环境中的无声传播。利奈唑胺耐药率较低，但optrA基因的检出表明可转移耐药元件的全球扩散趋势，土耳其首次发现optrA阳性E. faecalis具有特别意义。对于缺乏已知耐药基因的利奈唑胺耐药株，可能涉及23S rRNA或核糖体蛋白L3/L4的突变，但本研究未调查这些机制，需进一步研究。替加环素耐药率低，支持其在肠球菌感染中的持续体外活性。达托霉素耐药在VRE中虽罕见但值得关注，需优化给药策略。oritavancin的药敏解释仍存在挑战，缺乏统一的折点标准。
研究结论部分总结道，本研究通过对临床肠球菌分离株的抗菌药物耐药性、耐药机制和分子流行病学的综合评估，提供了关于三级医疗中心耐药景观的见解。万古霉素耐药主要由vanA基因型介导，万古霉素变异肠球菌的鉴定突显了单独表型测试的局限性及分子确认的必要性。尽管利奈唑胺和替加环素耐药率较低，但可转移耐药决定因子如optrA的检出表明最后防线药物耐药性进一步扩散的潜力。药敏试验方法与BMD参考方法总体表现出高的一致性，而分子分型揭示了显著的遗传多样性。这些发现支持采用表型和分子相结合的方法，以实现准确的耐药检测、有效的感染控制和持续的肠球菌感染监测。
