基于高维多组学数据的多重免疫荧光技术对MF的计算机自动化免疫表型分析

《JID Innovations》：High-Throughput, Multiplex Immunofluorescence for the Computer-automated Immunophenotyping of Mycosis Fungoides

　　

皮肤T细胞淋巴瘤中最常见的Mycosis Fungoides (MF) 诊断困难且常因常规免疫组织化学 (IHC) 仅能分析单一抗原而延误，这通常 necessitates 重复活检和 extensive workups。本研究旨在验证一种结合计算机自动化图像分析的高通量多重免疫荧光 (MIF) 方法，以从单个福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 活检样本中生成全面的免疫表型数据。研究人员将包含11种生物标志物的MIF面板应用于18个存档皮肤标本（9例MF/TCR克隆性阳性，9例对照/TCR克隆性阴性）。初步验证证实，MIF的抗原表达和空间定位与连续IHC染色切片一致。研究人员使用计算机辅助和计算机自动化流程分析了全切片图像堆栈。两种方法均成功 delineated 免疫表型差异。与对照组相比，MF标本显示出造血细胞、非典型T淋巴细胞和增殖性T淋巴细胞的显著扩张。研究结果验证了MIF从单一组织切片获取全面、高维诊断信息的潜力。与计算机自动化分析整合提供了一个可扩展的高通量平台，可显著协助及时且准确地诊断皮肤淋巴瘤。

皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）是一组罕见的皮肤恶性肿瘤，其中Mycosis Fungoides（MF）是最常见的亚型，其特征为单克隆恶性T细胞的扩张和积累。MF的诊断极具挑战性，特别是在疾病早期，由于临床表现和组化特征不典型，平均诊断延迟达2-4年，且每位患者平均需要2.89次活检。传统的诊断依赖于免疫组织化学（IHC），但其局限性在于单次组织切片通常仅能检测单一抗原，这不仅消耗组织样本，还常需进行T细胞受体（TCR）分子研究和流式细胞术等后续检查，难以在肿瘤微环境中同时可视化全面的免疫表型。为克服这些局限，多重免疫荧光（MIF）作为一种能够单次切片同时可视化多种细胞群的技术应运而生，其通过循环染色和图像获取，可实现>30种抗原的检测，并生成高维免疫表型数据。本研究旨在评估基于抗体的MIF检测方法在识别和量化MF皮肤组织切片中异常免疫细胞群方面的效用，并与良性炎症性皮肤病对照进行比较。研究人员验证了MIF相对于连续IHC和苏木精-伊红（H&E）染色的抗原表达和空间定位的一致性，并展示了利用两种不同的图像处理流程（计算机辅助和计算机自动化）从MIF数字全切片图像堆栈中生成免疫表型数据的潜力，旨在为皮肤淋巴瘤的及时准确诊断提供一种高通量平台。

研究人员共收集了18例存档福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）皮肤生物样本，其中9例经TCR基因克隆性分析确认为MF（阳性），9例为TCR基因克隆性阴性的对照病例，包括花环状皮炎和银屑病样皮炎等良性炎症性皮肤病。主要技术方法包括：首先，采用11种生物标志物的抗体面板进行4轮循环MIF染色，涵盖CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD30、CD45、CD47、Ki67和泛细胞角蛋白等标记物，以全面刻画细胞表型。其次，利用Zeiss Axioscan Z1高速自动图像采集系统获取高倍率荧光图像，并通过图像配准算法构建数字全切片图像堆栈。最后，采用两种不同的图像分析流程处理数据：一是基于QuPath开源软件的计算机辅助图像细胞计量学分析，进行细胞分割和阈值设定；二是基于steinbock toolkit的端到端计算机自动化图像分析和细胞分类流程，结合深度学习和层次聚类算法进行单细胞分辨率的数据生成。

研究结果表明，MIF在抗原表达和空间定位上与常规IHC高度一致，且MIF全切片图像堆栈量化的CD4:CD8比值与病理医师视觉检查及IHC定量结果具有显著相关性（72%的病例直接相关）。在全局免疫表型分析中，与对照组相比，MF标本显示出CD45+造血细胞群、CD4+ T淋巴细胞、Ki67+增殖细胞以及非典型CD4+,CD7- T淋巴细胞的显著扩张，导致上皮细胞相对百分比下降。在诊断参数方面，虽然CD4:CD8比值在两组间无显著差异，但MF标本中非典型CD45+,CD4+,CD7- T淋巴细胞百分比和增殖性CD4+ T淋巴细胞百分比显著升高。ROC曲线分析显示，增殖性T淋巴细胞指数（>20%，敏感度/特异度89%）、非典型CD4+,CD7- T淋巴细胞百分比（>65%，敏感度77.8%/特异度89%）和CD45+造血细胞百分比（>50%，敏感度/特异度89%）具有较高的诊断价值。此外，研究人员开发了基于上述四个参数的MIF复合评分系统，评分>7的截断值在区分MF和对照中达到了89%的敏感度和特异度。利用steinbock toolkit进行的计算机自动化分析也确认了上述趋势，识别出12种独特的细胞群，并发现MF样本中CD45+造血细胞、CD4+ T淋巴细胞和非典型T淋巴细胞比例显著增加，证明了计算机自动化MIF分析在皮肤淋巴瘤诊断中的可行性。

讨论部分指出，MIF能够从单一组织切片中获取高维度的免疫表型信息，有助于减少MF诊断所需的活检次数。研究成功识别出在TCR基因重排确认的MF病例中显著富集的非典型淋巴细胞群体，其特征为CD45+,CD4+,CD7-免疫表型。然而，研究也承认了当前抗体面板的局限性，未能涵盖所有CTCL亚型（如CD4+,CD7+或CD8+亚型），未来需纳入更多抗原如CD56、βF1、TCRγ/δ等。技术层面，循环MIF流程耗时长，且依赖昂贵的多通道荧光显微镜设备，标准化抗原提取和抗体孵育流程仍是普及的障碍。此外，光漂白步骤可能引入非特异性背景荧光，且在低密度细胞簇中通过steinbock toolkit分析时可能出现背景信号干扰。最后，图像处理的复杂性要求具备生物信息学和统计软件专业知识。研究结论认为，MIF结合自动化分析为改善皮肤癌症和炎症性皮肤病的诊断提供了重要框架，为开发特定疾病的MIF面板和成像技术奠定了基础，该成果发表于《JID Innovations》。