热毒宁通过抵抗病毒NS1介导的宿主I型干扰素信号抑制发挥抗流感活性

《Journal of Ethnopharmacology》：Re Du Ning exerts anti-influenza activity by counteracting viral NS1-mediated suppression of host type I interferon signaling

　　

民族药理学相关性：热毒宁（Re Du Ning, RDN）注射液是一种现代中药复方制剂，具有清热、疏风、解毒的功效，临床上用于治疗流感相关高热和上呼吸道感染，具有确切的临床疗效和良好的安全性。尽管其抗炎活性已被广泛记录，但RDN对甲型流感病毒（influenza A virus, IAV）的抗病毒作用仍有争议，且潜在机制尚未完全阐明。研究目的：探讨RDN通过抵抗病毒非结构蛋白1（nonstructural protein 1, NS1）介导的宿主I型干扰素（type I interferon, IFN-I）信号抑制发挥抗流感活性的机制和活性成分。材料与方法：通过监测死亡率、体重、肺指数、肺病毒载量和组织病理学变化评估RDN的抗IAV疗效。采用qRT-PCR和Western blot在体内特定时间点定量IFN-α/β和干扰素刺激基因（ISG15, MX1, OAS1, PKR）的表达，并评估IFNAR1/IFNAR2–JAK1/TYK2–STAT1/STAT2信号通路的激活。使用siRNA介导的敲低检测STAT1和STAT2对RDN抗病毒作用的贡献。通过评估干扰素刺激反应元件（interferon-stimulated response element, ISRE）–荧光素酶报告基因激活、JAK1/TYK2–STAT1/STAT2磷酸化、STAT1/STAT2核转位和NS1相关蛋白复合物，评估NS1对IFN-I信号的抑制及RDN的抑制作用。通过HPLC获得RDN及其极性组分的色谱图谱，并通过HPLC–Q-TOF–MS/MS鉴定峰成分。使用谱效关系分析鉴定抗NS1成分并随后进行验证。结果：RDN在小鼠中显著保护抵抗IAV感染，降低死亡率、减轻体重下降、降低肺指数和病毒载量、减轻肺损伤。感染后，RDN高剂量组的IFN-α/β表达持续低于模型组。相比之下，RDN高剂量组的ISG15, MX1, OAS1, PKR水平在感染后第1天和第2天与模型组相当，而ISG15和MX1在第4天显著升高。一致地，STAT1和STAT2磷酸化在第4天相对于模型组短暂增加。siRNA介导的STAT1或STAT2敲低减少了但未完全消除RDN的抗IAV活性。RDN剂量依赖性地抑制NS1（A/Puerto Rico/8/34, PR8）介导的ISRE-荧光素酶活性抑制。NS1抑制JAK1, TYK2, STAT1, STAT2的磷酸化并损害STAT1/STAT2核转位。RDN在体外和体内减轻了NS1介导的STAT1和STAT2磷酸化及核转位抑制。未观察到NS1与外源表达的STAT1或STAT2之间存在可检测的关联；然而，NS1与外源表达的JAK1和TYK2相关联，而RDN减弱了这些关联。绿原酸（chlorogenic acid）被鉴定为主要贡献成分之一，它减弱了NS1–JAK1关联并减轻了NS1介导的STAT1/STAT2磷酸化抑制。相比之下，新绿原酸（neochlorogenic acid）减轻了NS1介导的STAT1磷酸化抑制，但未显著影响NS1–JAK1或NS1–TYK2关联。结论：本研究表明RDN具有显著的抗IAV活性。JAK1和TYK2可能是以前被低估的与PR8 NS1相关的宿主激酶。RDN可能通过减弱NS1–JAK1/TYK2关联部分恢复宿主IFN-I–JAK/STAT–ISG抗病毒信号。绿原酸被鉴定为贡献RDN抗NS1活性的主要成分之一。这些发现为RDN的宿主导向抗病毒活性提供了机制见解。

**论文解读：热毒宁通过抵抗病毒NS1介导的宿主I型干扰素信号抑制发挥抗流感活性**

**研究背景与问题**
流感主要由甲型流感病毒（IAV）引起，每年全球约10亿人感染，其中300-500万例发展为重症，29-65万例死亡。IAV的高突变率和遗传多样性削弱了疫苗效力，而现有抗病毒药物（如M2抑制剂、神经氨酸酶抑制剂、RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂）的耐药株不断出现，进一步复杂化了防治。因此，亟需新型治疗策略和药物开发。IAV感染后迅速激活先天免疫系统，触发干扰素产生，建立抗病毒状态。I型干扰素（IFN-I）通过结合干扰素受体（IFNAR1/IFNAR2），激活JAK1/TYK2–STAT1/STAT2信号级联，诱导数百种干扰素刺激基因（ISGs）转录，其产物抑制病毒生命周期多个阶段。有效的早期IFN-I应答对于限制IAV复制和致病性至关重要。然而，IAV进化出多种逃逸宿主抗病毒免疫的机制，其中非结构蛋白1（NS1）作为关键毒力因子，通过抑制IFN-I–JAK/STAT信号，损害ISG诱导，促进病毒复制。靶向NS1介导的免疫逃逸以恢复IFN-I抗病毒活性，是一种有前景的宿主导向策略。热毒宁（RDN）注射液是一种现代标准化中药复方制剂，由青蒿、金银花、栀子提取制备，2005年在中国获批上市，临床用于治疗流感相关高热、上呼吸道感染和急性支气管炎。临床试验显示其可退热、缓解流感样症状，100,000例儿科真实世界研究支持其安全性，不良反应率仅0.076%。随机双盲对照试验证明RDN相比奥司他韦更能缩短病程、缓解发热寒战咽痛鼻塞。体外研究表明RDN通过抑制神经氨酸酶、促进Nrf2核转位、通过HO-1激活增强IFN-I表达而发挥抗流感活性；体内研究显示RDN减轻IAV感染小鼠肺部炎症和损伤。然而，RDN的直接抗IAV活性仍存争议，机制特别是涉及宿主抗病毒信号的部分尚未完全阐明。因此，需进一步明确其抗病毒效力及机制，特别是宿主抗病毒应答方面。

**研究内容与结论**
研究人员评估了RDN在体内的抗IAV活性，并探究其对IFN-I–JAK1/TYK2–STAT1/STAT2抗病毒通路的影响。鉴于NS1干扰IFN-I–JAK/STAT信号在病毒免疫逃逸中的核心作用，进一步检验RDN是否能抵抗NS1介导的IFN-I信号抑制。采用谱效关系策略结合药理学验证鉴定相关活性成分。结论：RDN具有显著抗IAV活性，JAK1和TYK2可能是以前被低估的与PR8 NS1相关的宿主激酶，RDN通过减弱NS1–JAK1/TYK2关联部分恢复宿主IFN-I–JAK/STAT–ISG抗病毒信号，绿原酸是贡献抗NS1活性的主要成分之一。论文发表在《Journal of Ethnopharmacology》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用IAV感染小鼠模型（致死性和亚致死性），通过监测死亡率、体重、肺指数、肺病毒载量及组织病理学评估抗病毒效果。利用qRT-PCR和Western blot检测IFN-α/β及ISGs（ISG15、MX1、OAS1、PKR）表达，并评估IFNAR1/IFNAR2–JAK1/TYK2–STAT1/STAT2通路激活。使用siRNA敲低STAT1或STAT2检验其对RDN抗病毒作用的贡献。通过ISRE-荧光素酶报告基因、JAK1/TYK2–STAT1/STAT2磷酸化、STAT1/STAT2核转位及免疫共沉淀评估NS1对IFN-I信号的抑制及RDN的逆转作用。采用HPLC–Q-TOF–MS/MS进行成分鉴定，并结合谱效关系分析筛选抗NS1活性成分。

**研究结果**
（1）**RDN exhibits significant anti-H1N1 activity in vivo**：在致死性H1N1感染模型中，模型组小鼠第6天开始死亡，第8天全部死亡；RDN高剂量组（11 mL/kg/天）存活率达83.3%，低剂量组（5.5 mL/kg/天）为66.7%。在亚致死性模型中，RDN高剂量组显著减轻体重下降（第4-6天），降低肺指数和肺病毒载量，减轻肺组织病理损伤。

（2）**RDN partially restored IFN-I–ISG antiviral signaling**：感染后第1、2天，RDN高剂量组IFN-α/β mRNA水平低于模型组，但ISG15、MX1、OAS1、PKR水平与模型组相当；第4天，ISG15和MX1 mRNA显著高于模型组。表明RDN并未诱导IFN-I早期产生，但增强了后期ISG表达。

（3）**RDN restored IFN-I–JAK1/TYK2–STAT1/STAT2 signaling**：第4天，RDN高剂量组STAT1和STAT2磷酸化水平高于模型组；第2天则无明显差异；第1天甚至低于模型组。JAK1和TYK2磷酸化在第4天也高于模型组。

（4）**RDN promoted antiviral signaling independently of STAT1/STAT2**：siRNA敲低STAT1或STAT2后，RDN的抗IAV活性（减少病毒核蛋白NP表达）部分减弱但未完全消除，说明STAT1/STAT2部分介导但非唯一途径。

（5）**RDN restored NS1-mediated suppression of IFN-I signaling**：在过表达PR8 NS1的HEK293T细胞中，RDN剂量依赖性地逆转NS1对ISRE-荧光素酶活性的抑制，且逆转效率与NS1表达量相关。

（6）**RDN mitigated NS1-mediated suppression of STAT1/STAT2 signaling in vitro and in vivo**：Western blot显示NS1抑制JAK1、TYK2、STAT1、STAT2磷酸化及STAT1/STAT2核转位；RDN在HEK293T细胞和小鼠肺组织中均逆转了这些抑制。免疫荧光证实RDN恢复STAT1核转位。

（7）**RDN attenuated NS1–JAK1/TYK2 associations in cells**：免疫共沉淀显示，NS1与外源表达的JAK1和TYK2结合，但不与STAT1/STAT2结合；RDN处理减弱了NS1–JAK1和NS1–TYK2的关联。

（8）**Identification of anti-NS1 constituents in RDN**：HPLC–Q-TOF–MS/MS鉴定出RDN中42个峰，谱效相关性分析筛选出与抗NS1活性高度相关的10个成分，其中绿原酸（峰5）相关性最强。验证实验证明绿原酸和新绿原酸均可部分逆转NS1介导的STAT1/STAT2磷酸化抑制；绿原酸减弱NS1–JAK1关联，而新绿原酸不显著影响NS1–JAK1或NS1–TYK2关联。新绿原酸单独对STAT1磷酸化有恢复作用。

**讨论与结论**
讨论部分指出，RDN在IAV小鼠模型中表现出显著抗病毒活性，高剂量（11 mL/kg/天）效果优于低剂量，与既往研究（Ma et al., 2016）中低剂量（0.14 mL/kg/天）腹腔注射未降低病毒载量结果不同，提示剂量和给药途径影响疗效。RDN未诱导早期IFN-α/β升高，但在感染后期增强ISG表达，表明其通过恢复受NS1抑制的IFN-I信号通路发挥作用，而非直接诱导IFN。机制上，NS1通过直接结合宿主JAK1和TYK2抑制信号传导，RDN通过减弱该结合恢复JAK/STAT激活。绿原酸是主要抗NS1成分之一，通过破坏NS1–JAK1关联发挥作用；新绿原酸则通过其他机制恢复STAT1磷酸化。结论：本研究为RDN抗流感作用提供机制见解。JAK1和TYK2可能是以前被低估的与PR8 NS1相关的宿主激酶。RDN通过减弱NS1–JAK1/TYK2关联部分恢复宿主IFN-I–JAK/STAT–ISG抗病毒信号。通过谱效关系策略结合药理学验证，绿原酸被鉴定为贡献RDN抗NS1活性的主要成分之一。