人源SMUG1（single-strand-selective monofunctional uracil DNA glycosylase 1, hSMUG1）切除DNA中尿嘧啶的结构基础

《Nature Communications》：Structural basis for uracil removal from DNA by human SMUG1

　　

人源单链选择性单功能尿嘧啶DNA糖苷酶1（human single-strand-selective monofunctional uracil DNA glycosylase 1, hSMUG1）可从DNA中移除尿嘧啶（uracil）、5-羟甲基尿嘧啶（5-hydroxymethyluracil, 5hmU）及5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5FU），从而启动碱基切除修复（Base Excision Repair, BER）过程。hSMUG1对维持基因组完整性具有重要意义，并在肿瘤生物学中发挥重要作用。研究人员在此报道了hSMUG1的多种晶体结构，包括与产物（尿嘧啶及5FU）的复合物，以及与双链DNA（double-stranded DNA, dsDNA）的酶–产物复合物。通过对hSMUG1–dsDNA复合物的分析，研究人员揭示了尿嘧啶如何被从dsDNA双螺旋中翻出（base flipping）并切除，鉴定了对于DNA结合及酶活性均至关重要的关键残基并经实验验证。此外，hSMUG1底物复合物、分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟及中子衍射数据显示，切除后的底物尿嘧啶可在活性口袋内发生旋转。本文所提供结构与功能信息将为未来开发靶向hSMUG1的抑制剂及/或激活剂提供重要依据。

《Nature Communications》论文解读：人源SMUG1切除DNA中尿嘧啶的结构基础

一、研究背景与意义

碱基切除修复（Base Excision Repair, BER）是细胞纠正DNA中小碱基损伤的主要途径，由DNA糖苷酶（DNA glycosylase）启动，其中尿嘧啶DNA糖苷酶（Uracil DNA Glycosylase, UDG）超家族成员hUNG、hSMUG1和hTDG负责识别并水解N-糖苷键切除尿嘧啶等损伤碱基。hSMUG1可去除dsDNA和单链DNA（single-stranded DNA, ssDNA）中的尿嘧啶、5hmU、5-氟尿嘧啶（5FU）及5-羟基尿嘧啶（5-OHU），并在UNG缺失时起备份作用，其异常表达与多种癌症预后相关，是潜在的抗癌药物靶点。此前hUNG已有较多结构研究，但hSMUG1的高分辨率结构及其与DNA相互作用、底物识别与催化的分子机制尚不清楚。本研究解析了hSMUG1的脱辅基（apo）形式、与产物尿嘧啶及5FU的复合物、以及与含无碱基位点（abasic site / AP site）dsDNA的复合物，并结合生化、MD模拟和中子衍射阐明其DNA结合、碱基翻出、催化后尿嘧啶旋转及胸腺嘧啶排斥机制，为靶向hSMUG1的药物设计奠定基础。

二、主要关键技术方法

研究人员表达纯化截短（ΔN24）及全长hSMUG1野生型及定点突变体（R124A、R215A、R243A、N85A等）和人脱嘌呤/脱嘧啶内切酶1（Apurinic/apyrimidinic Endonuclease 1, hAPE1）；合成含尿嘧啶、AP位点或硫代磷酸酯修饰的dsDNA/ssDNA寡核苷酸并退火；采用X射线晶体学解析hSMUG1-apo、hSMUG1–尿嘧啶、hSMUG1–5FU、hSMUG1–dsDNA（含AP位点）及hAPE1–dsDNA复合物结构；对hSMUG1–全氘代尿嘧啶复合物进行中子衍射实验确定质子化状态；通过分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟及自由能微扰（Free Energy Perturbation, FEP）计算比较尿嘧啶"原生（native）"与"旋转（rotated）"构象及尿嘧啶与胸腺嘧啶的结合自由能差异；利用微量热泳（Microscale Thermophoresis, MST）测定蛋白与DNA的解离常数（K_d）；采用荧光偶联APE1的活性检测法测定hSMUG1糖苷酶活性及动力学参数。

三、研究结果

hSMUG1是UDG蛋白超家族成员

研究人员解析了hSMUG1 apo结构（1.38 ?），含八段α螺旋、六条β链和六段3₁₀螺旋，具UDG超家族典型的四链平行β片层夹α螺旋核心模体，但与hTDG和hUNG2（Uracil DNA Glycosylase 2）整体结构差异较大（Cα RMSD分别为2.8 ?和4.3 ?）。

hSMUG1通过R124、R215和H239-K249区域结合DNA

共结晶获得hSMUG1与含尿嘧啶12 bp dsDNA的复合物，结晶中尿嘧啶已被切除留下AP位点。dsDNA结合于蛋白带正电沟槽，Loop区H239-K249（尤其R243）作为DNA穿透楔插入双螺旋促使尿嘧啶翻出。氢键网络分析显示R124、S137、R187、R215、H239、S241、N244等与DNA磷酸骨架相互作用，R243和N248与对侧碱基作用。apo与DNA结合态整体RMSD仅0.57 ?，主要差异在H239-K249环及R215、R243、N248侧链构象变化。非生产性末端结合模式亦被观察到。

SMUG1产物复合物提示切除后碱基可能发生旋转

尿嘧啶及5FU浸泡获得hSMUG1–尿嘧啶（0.95 ?）和hSMUG1–5FU（1.90 ?）复合物，产物定位于相同口袋并通过M84主链氮、N163和H239侧链形成氢键，F98提供π-π堆积。5FU因5位氟还与S137、H239形成额外氢键。比对hSMUG1–dsDNA与产物复合物显示切除后尿嘧啶距AP位点脱氧核糖3.4 ?。MD模拟预催化状态显示翻转入位的尿嘧啶可与关键残基形成稳定氢键且存在潜在催化水分子。因尿嘧啶N3–C6轴具C₂对称轴，切除后可采取与原进入方向差约180°的"旋转"取向；FEP计算表明旋转取向比原生取向结合自由能低1.59±0.16 kcal/mol更有利，MD中旋转取向更稳定（中位RMSD 0.98 ? vs 2.31 ?）且维持关键氢键，原生取向易丢失与N163和M84的氢键。5FU无C₂对称轴，其结合明确呈旋转类取向。中子衍射直接证实尿嘧啶取旋转取向——N1接受水分子氢键、O4与质子化H239(Nε2)氢键、O2与F98主链酰胺氢键、O4与M84主链酰胺氢键、N163呈特定质子化态与尿嘧啶形成双氢键，支持切除后尿嘧啶旋转模型。

SMUG1对尿嘧啶优于胸腺嘧啶的选择性

MD模拟胸腺嘧啶作底物时被排开无法形成五重氢键，N163–胸腺嘧啶氢键占有率<10%（尿嘧啶80%）。FEP计算得ΔΔG_bind(尿嘧啶–胸腺嘧啶)=1.54±0.15 kcal/mol偏向尿嘧啶。胸腺嘧啶5位甲基与E135侧链及有序水分子发生空间位阻，破坏关键水网络，故被排斥。

hAPE1在尿嘧啶切除后竞争取代hSMUG1脱离dsDNA

hSMUG1切除尿嘧啶后对含AP位点dsDNA呈产物抑制，共结晶加hAPE1、硫代磷酸酯保护dsDNA只得到hAPE1–AP-dsDNA复合物，表明hAPE1对AP位点表观亲和力高于hSMUG1，可在后续步骤取代hSMUG1行切口活性，与文献报道一致。

hSMUG1精氨酸突变为丙氨酸降低DNA亲和力与酶活性

关键DNA邻近精氨酸R124A、R215A、R243A突变体酶活显著下降：R124A催化效率(k_cat/K_m)较WT降约60倍，R215A降约25倍，R243A降约7倍（主要因k_cat降6倍，K_m相近）。MST显示三突变体与各类dsDNA/ssDNA底物结合均减弱，WT对含尿嘧啶dsDNA亲和力最高(nM级)，对AP-dsDNA较弱，对ssDNA极弱；催化失活N85A与WT结合力无差异证明紧密结合不依赖即时切割。R215A几乎丧失与未修饰dsDNA/ssDNA结合能力。

四、讨论与结论翻译

研究人员报道了hSMUG1的晶体结构，包括处于催化相关状态的SMUG1–DNA复合物。dsDNA结合于宽正电沟槽，蛋白反面存负电区可能与DKC1等互作有关。DNA结合结构中含AP位点代表快速切除后的松弛产物抑制态。DNA穿透环界定为H239-K249，R243执行碱基翻出。精氨酸R124、R215及R243对DNA结合与定位至关重要，突变削弱结合与活性，R243A还影响催化后步骤。产物复合物、FEP与中子衍射共同支持尿嘧啶N-糖苷键水解后在活性口袋绕N3–C6轴约180°旋转，此旋转可能阻碍逆反应（尿嘧啶重新连接DNA）。hSMUG1借空间位阻与不利化学作用（胸腺嘧啶5-CH₃与E135及有序水冲突）排斥胸腺嘧啶。与hUNG2和hTDG活性口袋比较显示SMUG1较宽容C5位取代（可接受5FU、5hmU），具更极性正电环境。综上，本研究提供了hSMUG1–apo、–尿嘧啶、–5FU、–dsDNA(AP)及hAPE1–dsDNA结构，结合生化、MST、FEP阐明了该重要糖苷酶DNA修复机制，为开发hSMUG1靶向抑制剂/激活剂奠定基础。