《Journal of Proteome Research》：Coupling Far-Western Blotting with Peptide Microarrays Reveals Novel E?Cadherin Spore-Surface Ligands in Clostridioides difficile
编辑推荐：
艰难梭菌（Clostridioides difficile）是一种严格厌氧的产孢子细菌，是医院获得性腹泻的首要病因。该菌被美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention, CDC）列为对美国医疗系统
艰难梭菌（Clostridioides difficile）是一种严格厌氧的产孢子细菌，是医院获得性腹泻的首要病因。该菌被美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention, CDC）列为对美国医疗系统的"紧迫威胁"。艰难梭菌感染（C. difficile infection, CDI）每年导致超过22万例病例，相关医疗支出近48亿美元，死亡率达5–8%。CDI的发病率与抗生素使用密切相关，抗生素破坏肠道菌群平衡，为孢子萌发和细菌增殖创造条件。当前治疗主要依赖抗生素，复发病例则需更多抗生素和/或粪菌移植。然而，抗生素本身仍是复发的主要风险因素，20–30%的CDI患者出现复发，多次发作后复发率可高达60%。复发性CDI（R-CDI）主要归因于治疗后代谢休眠、耐氧孢子在宿主体内持续存在。
艰难梭菌孢子是细菌的感染和传播形式，在疾病复发和传播中起核心作用。外被层（exosporium）是孢子最外层，是首先与宿主肠表面相互作用的屏障。艰难梭菌产生两种外被层形态：具厚而致密外被层（常具极性突起）的孢子和具薄外被层的孢子，二者在产孢过程中同时形成。这种外被层变异性似乎为艰难梭菌所特有，可能为其占据特定生态位提供竞争优势。艰难梭菌孢子整体超微结构与其他产内生孢子菌相似，但仅25%的孢子被膜基因与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）同源，凸显了艰难梭菌孢子表面蛋白质组的独特性。
早期研究揭示艰难梭菌孢子通过孢子表面蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用黏附于人肠道样Caco-2细胞，且偏好结合基底外侧膜。竞争性结合实验进一步表明孢子黏附具有浓度依赖性，由细胞受体介导。电子显微图像支持艰难梭菌孢子表面毛发状突起可能介导孢子与宿主细胞膜及Caco-2细胞顶端微绒毛的结合。然而，孢子表面配体的身份仍未知。
在肠道上皮中，紧密连接（tight junctions, TJs）和黏附连接（adherens junctions, AJs）形成顶端连接复合体（apical junctional complex, AJC），保障屏障完整性。E-钙黏蛋白（E-cadherin）是AJs的核心跨膜蛋白，通过连接连环蛋白（catenin）和肌动蛋白细胞骨架来协调细胞-细胞黏附。E-钙黏蛋白通常局限于基底外侧结构域，但在特定条件下可及，如细胞挤出部位的凋亡细胞、杯状细胞的侧膜以及因组织张力和收缩力产生的肠绒毛上皮折叠处。艰难梭菌两种毒素TcdA和TcdB均为葡萄糖基转移酶，特异性修饰宿主细胞内的Rho家族GTP酶（包括RhoA、Rac1和Cdc42）。这种共价修饰使其GTP酶活性失活，导致肌动蛋白细胞骨架破坏以及紧密连接和黏附连接的解体。结果，这些毒素破坏上皮屏障并增加细胞旁通透性。在CDI背景下，毒素TcdA和TcdB诱导E-钙黏蛋白重新分布，增加其在肠上皮细胞顶端和基底表面的可及性。CDI期间E-钙黏蛋白可及性的增强与艰难梭菌孢子黏附增加相关，尤其是具厚外被层的孢子对破坏的上皮屏障的黏附，并优先结合基底外侧膜。
在大多数临床相关艰难梭菌菌株（包括R20291菌株）中，最外层外被层具有由BclA家族胶原样蛋白成员形成的毛发状突起。电子显微图像结合免疫金标记显示E-钙黏蛋白定位于这些毛发状突起。然而，单个bclA基因失活不影响E-钙黏蛋白结合，提示存在其他未鉴定配体参与该相互作用。蛋白质组学分析揭示艰难梭菌630孢子外被层中存在184种蛋白质，其中8种可被抗体识别，提示其可能参与孢子-宿主相互作用。这些抗体可及蛋白中包括孢子被膜蛋白CotA和CotB，它们在孢子被膜和外被层完整性中起次要作用，但其致病作用未知。CotE是一种孢子被膜蛋白，为含有过氧化物还原酶N端结构域和几丁质酶C端结构域的双功能酶，促进黏蛋白结合并有助于定植。在可及外被层蛋白中还包括两种富含半胱氨酸的形态发生蛋白CdeC和CdeM，它们对孢子外被层形成至关重要，cdeC和cdeM孢子影响其对肠道黏膜的黏附和致病性。尽管外被层的组成和组装已有显著进展，但负责与E-钙黏蛋白相互作用的孢子配体身份仍未知。
在本研究中，研究人员旨在鉴定艰难梭菌孢子与E-钙黏蛋白结合的配体。通过远Western印迹联合质谱技术，鉴定出34个候选蛋白，其中13个被选定用于评估重组蛋白与E-钙黏蛋白的结合。远Western印迹分析显示四种孢子蛋白（CotE、CdeM、CDIF27147_03838和CDIF27147_02282）为E-钙黏蛋白配体。肽段微阵列分析在这些蛋白质中定位了离散的E-钙黏蛋白结合区域，对应于9-20个残基的基序，通过AlphaFold预测为表面暴露。然而，使用这些基序合成肽的竞争性E-钙黏蛋白下拉实验并未减少E-钙黏蛋白与艰难梭菌孢子的结合。比较基因组学显示这些配体和基序在所有五个经典艰难梭菌克隆群（C1-C5）中保守。五个经典克隆群的孢子表现出相似的E-钙黏蛋白结合水平。该研究将CDIF27147_03838和CDIF27147_02282鉴定为新型E-钙黏蛋白配体，并提示CotE和CdeM具有额外作用，拓展了对孢子-宿主相互作用的认识。该论文发表于《Journal of Proteome Research》。
研究人员开展此项研究的背景在于艰难梭菌感染复发率居高不下，孢子持续存在是核心难题，而孢子如何黏附于肠道上皮的具体分子机制尚不清楚。此前研究团队已发现宿主细胞表面的E-钙黏蛋白是介导孢子黏附的关键受体，但孢子表面的具体配体未知。本研究旨在鉴定这些配体，以深入理解孢子-宿主相互作用机制，为干预孢子持续感染提供潜在靶点。
研究人员采用的关键技术方法包括：远Western印迹（Far-Western Blotting）结合串联质谱（MS/MS）蛋白质鉴定技术；构象性肽段微阵列（Conformational Peptide Microarrays）用于定位E-钙黏蛋白结合基序；AlphaFold3蛋白质结构预测用于分析结合基序的表面可及性；基于250株艰难梭菌基因组数据（每克隆群50株）的比较基因组学分析；以及E-钙黏蛋白下拉结合实验结合免疫印迹定量。样本来源包括高发孢子突变株R20291CM196及代表五个经典克隆群的多株临床菌株。
E-钙黏蛋白以纳摩尔亲和力结合艰难梭菌孢子：通过E-钙黏蛋白下拉结合实验和单孢子免疫荧光分析，研究人员测得E-钙黏蛋白与孢子相互作用的解离常数（K
d）为109.9 nM ± 15.8 nM，表明具有中等强度的纳摩尔亲和力。单孢子免疫荧光分析揭示了异质性和双模态E-钙黏蛋白结合模式，存在高结合和低结合两个孢子亚群，且随E-浓度增加，E-钙黏蛋白阳性孢子比例从2 μg/mL时的67.8%上升至4 μg/mL及以上时的约97%。
二维远Western印迹鉴定孢子E-钙黏蛋白配体：一维远Western印迹显示约56 kDa和~20 kDa两条主要免疫反应带。二维远Western印迹鉴定出17-20个免疫反应斑点，等电点范围pH 4.0-5.5，表观分子量12.5-85 kDa。经串联质谱鉴定和逐步过滤筛选，确定25个受孢子形成特异性σ因子σ
E和/或σ
K调控的蛋白，其中13个已知定位于外被层或孢子被膜。
重组CotE、CdeM、CDIF27147_02282和CDIF27147_03838与E-钙黏蛋白相互作用：在13个候选蛋白的重组表达和远Western验证中，仅CotE、CdeM、CDIF27147_02282和CDIF27147_03838显示E-钙黏蛋白结合活性。其中12个构建体在E. coli中形成包涵体，CDIF27147_00446和CDIF27147_02282可溶于上清。
CotE、CdeM、CDIF27147_02282和CDIF27147_03838在艰难梭菌五个经典克隆群中保守：通过tBLASTn对250株基因组进行分析，四个配体在所有克隆群中均显示高度氨基酸保守性（92.7-99.4%），其中CotE最保守（平均99%），CdeM变异最大（克隆群5为92.7%）。
艰难梭菌孢子跨五个经典克隆群对E-钙黏蛋白的结合保守：来自五个克隆群代表菌株的孢子均显示与参考株R20291相当的E-钙黏蛋白结合水平，克隆群4菌株的结合略高于参考株但未达统计学显著性。外被层/被膜提取物的蛋白质带型存在差异，提示组成差异可能不影响E-钙黏蛋白结合亲和力。
肽段微阵列鉴定孢子配体中E-钙黏蛋白结合基序：在1 μg/mL E-钙黏蛋白浓度下，CotE中鉴定出高亲和力基序CotE_4（KKHTKNTNK，273-281位）和CotE_7（KNTKKIAMKTLK，339-350位），以及中等亲和力基序CotE_1、CotE_2和CotE_6。CdeM中鉴定出CdeM_1和CdeM_5，CDIF27147_02282中鉴定出2282_3，CDIF27147_03838中鉴定出3838_1、3838_2和3838_4。BclA2和BclA3的C端结构域未显示显著E-钙黏蛋白结合。在10 μg/mL浓度下，各蛋白中检测到更多结合区域，表明E-钙黏蛋白结合能力分布于多个区域。
孢子配体E-钙黏蛋白结合基序的表面可及性、酸性和亲水性特征：AlphaFold3结构预测显示，结合基序多为表面暴露、9-20个氨基酸、以亲水性或酸性为特征，常位于灵活的α-螺旋或卷曲结构中。CotE_4和CotE_7具有强正表面电荷。CotE定位于外被层下的外孢子被膜，CdeM为外被层形态发生蛋白，CDIF27147_02282和CDIF27147_03838被鉴定于外被层/被膜富集的表面提取物中。
合成肽未能抑制E-钙黏蛋白与艰难梭菌孢子的结合：1-15 μM浓度的合成肽均未能竞争性抑制E-钙黏蛋白与孢子的结合，包括单独使用或联合使用所有CotE来源肽段。相反，CotE_1合成肽导致E-钙黏蛋白结合剂量依赖性增加3.5倍。
讨论部分，研究人员指出复发性艰难梭菌感染仍是临床管理的重大挑战，孢子表面蛋白与宿主细胞蛋白（包括E-钙黏蛋白、玻连蛋白和纤连蛋白）的直接相互作用在孢子黏附或内化至肠上皮细胞中起核心作用，这些表型与疾病复发相关。此前的研究还表明，TcdA和TcdB毒素破坏细胞-细胞连接可增加E-钙黏蛋白的可及性，从而增加孢子黏附。
本研究的主要贡献在于鉴定了CotE、CdeM以及两个先前未表征的外被层或被膜蛋白CDIF27147_02282和CDIF27147_03838作为E-钙黏蛋白孢子表面配体。CotE是一种双功能蛋白，参与黏蛋白结合和降解以及体内定植；CdeM参与外被层组装，其破坏导致孢子对上皮细胞黏附降低和在健康宿主黏膜中定植受损。本研究数据拓展了这些功能，证明二者均具有多个E-钙黏蛋白结合基序，主要聚集于可及的α-螺旋和卷曲区域。此外，CotE的C端几丁质酶折叠富含E-钙黏蛋白结合位点。本研究还发现BclA2和BclA3的C端结构域不具有E-钙黏蛋白结合基序，这与此前bclA2和bclA3突变株显示野生型甚至增强的E-钙黏蛋白结合的观察一致。
本研究还将 repertoire 扩展至两个先前未表征的蛋白CDIF27147_02282和CDIF27147_03838，其表达受孢子形成特异性σ因子σ
E和σ
K调控。CDIF27147_02282具有预测的黄素还原酶结构域，其E-钙黏蛋白结合基序位于预测功能结构域内暴露的α-螺旋中。CDIF27147_03838为YmaF家族同源物，此前与芽孢杆菌属的孢子萌发相关，其三个E-钙黏蛋白结合基序位于预测YmaF结构域上游的卷曲和α-螺旋区域，提示该蛋白具有两个功能结构域。
第二个主要结论是E-钙黏蛋白以预测的K
d = 109.9 nM纳摩尔亲和力与艰难梭菌孢子结合。该亲和力属于低至中纳摩尔范围的中等亲和力，具有生理学意义。与单核细胞增生李斯特菌InlA-E-钙黏蛋白复合物（K
d = 8 μM）相比，该亲和力显著更高，凸显了E-钙黏蛋白结合在艰难梭菌孢子黏附中的潜在生物学重要性。该亲和力还与纤连蛋白（K
d = 20.8 nM）和玻连蛋白（K
d = 106.5 nM）等其他宿主糖蛋白的亲和力相当。
第三个主要结论是E-钙黏蛋白与艰难梭菌孢子的结合呈异质性，仅结合部分孢子。该观察与之一致，提示孢子表面的配体变异。
第四个结论是不同克隆群的艰难梭菌孢子对E-钙黏蛋白的结合相等，表明上皮黏附是临床相关经典克隆群中保守的特性。尽管各克隆群的流行病学、宿主关联和毒力不同，但CotE、CdeM、CDIF27147_02282和CDIF27147_03838及其E-钙黏蛋白结合基序在五个经典克隆群中均保守。然而，基序水平的分析揭示，虽然CotE_1、CotE_2、CotE_4、CotE_7、2282_3和3838_4等基序高度保守（>95%配对同一性），但CotE_6、CdeM_1、CdeM_5、3838_1和3838_2等基序显示显著的克隆依赖性多样性。
值得注意的观察是合成肽未能通过竞争性抑制减少艰难梭菌孢子与E-钙黏蛋白的结合。这可能是因为线性肽缺乏天然蛋白中复杂的三维构象特征，以及E-钙黏蛋白-孢子结合的分子界面可能较为复杂，多个基序可能共同参与冗余结合。
研究结论：本研究鉴定了四个保守的E-钙黏蛋白配体候选蛋白（CotE、CdeM、CDIF27147_02282和CDIF27147_03838），拓展了已知孢子表面蛋白库。仅部分孢子（可能为具厚外被层者）结合E-钙黏蛋白，凸显了表型异质性及其对感染期间定植动力学的影响。跨克隆群可比的E-钙黏蛋白结合亲和力表明该相互作用是广泛维持的机制，可能有助于孢子持续存在。未来工作包括交联质谱以进行详细残基界面分析、靶向诱变和体内研究，以阐明各配体对孢子黏附和致病的具体贡献。
