BRCA2意义未明变异在韩国乳腺癌患者中的功能性状表征

《Breast Cancer》：Functional characterization of BRCA2 variants of uncertain significance identified in Korean breast cancer patients

　　

意义未问变异（VUS）在BRCA2中的存在仍然是乳腺癌临床管理中的主要挑战，尤其在亚洲人群中，由于群体特异性参考数据有限，这一问题尤为突出。功能性检测可为这些变异体的解读提供补充性生物学证据。研究人员选取了三个BRCA2错义VUS——c.5969 A > C (p.Asp1990Ala)、c.3671G > A (p.Gly1224Asp)和c.5459G > A (p.Cys1820Tyr)——基于其在韩国队列中的频率和/或强烈的乳腺癌家族史进行筛选。将这些携带各变异体的全长BRCA2构建体导入BRCA2敲除的DLD-1细胞中。通过顺铂处理和电离辐射后的细胞敏感性检测、PARP抑制剂（PARP inhibitor）奥拉帕利（olaparib）反应，以及基于GFP（绿色荧光蛋白）报告系统的同源重组（HR）效率评估等方法，评价各变异体的功能学后果。表达BRCA2 p.Asp1990Ala的细胞在顺铂、电离辐射和奥拉帕利处理后均表现出一致性增高的敏感性，与致病性对照相媲美。此外，基于GFP的HR检测显示p.Asp1990Ala表达细胞的HR修复效率显著降低。相比之下，表达BRCA2 p.Gly1224Asp或p.Cys1820Tyr的细胞在所有检测中均表现出与野生型BRCA2相似的DNA损伤反应、药物敏感性谱和HR活性。在三个分析的BRCA2 VUS中，p.Asp1990Ala表现出以同源重组修复受损为特征的致病性功能表型，而p.Gly1224Asp和p.Cys1820Tyr则表现为功能中性。这些发现凸显了BRCA2 VUS的功能异质性，并支持功能性检测作为乳腺癌变异解读补充工具的作用。

乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤，遗传性易感性在疾病发生和治疗决策中起着关键作用。BRCA2作为核心的肿瘤抑制基因，其功能完整性对维持基因组稳定性至关重要。致病性BRCA2变异与终身乳腺癌风险显著增加相关，并对癌症监测、风险降低策略和系统治疗选择具有直接影响。BRCA2蛋白在同源重组（HR）中发挥关键作用，HR是一种高保真度的DNA修复通路，负责精确修复DNA双链断裂。通过与RAD51的直接相互作用，BRCA2促进核蛋白丝形成和链侵入，从而确保无误的DNA修复。BRCA2功能丧失导致同源重组缺陷（HRD），引发基因组不稳定性和对DNA损伤剂（包括铂类化疗和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂）的敏感性增高。该论文发表在《Breast Cancer》。

随着下一代测序技术的广泛应用，特别是基于肿瘤的基因组分析，BRCA2变异的临床解读变得日益复杂。肿瘤测序经常发现变异等位基因频率接近50%的BRCA变异，这一发现强烈提示生殖系起源。在临床实践中，此类结果常引发遗传性癌症易感性的怀疑，尤其在早发疾病患者或具有提示性家族史的患者中。然而，尽管具备这些特征，相当比例的这类变异最终被归类为意义未明变异（VUS）。与具有明确临床后果的截断变异不同，错义BRCA2变异往往缺乏充分证据进行明确的致病性或良性分类，这在临床中造成了一个具有挑战性的灰色地带。

这一解读差距在非白种人群中尤为突出。当前变异分类框架，包括美国医学遗传学与基因组学学会和分子病理学协会（ACMG/AMP）指南，主要依赖于人群频率数据、既往报告的临床证据和参考数据库，而这些数据大多来源于白种人群。因此，这些标准在亚洲人群中的应用受到限制。多项研究报告了东亚乳腺癌队列（包括韩国患者）中更高的BRCA1/2 VUS率，反映了群体特异性遗传结构和全球数据库中代表性不足的双重问题。基于此背景，韩国开展了K-MASTER全国性精准肿瘤学计划，对约10,000例癌症患者进行大规模肿瘤基因组分析，使研究人员能够系统分析包括BRCA基因在内的各种实体瘤的基因组改变。该计划发现K-MASTER队列中识别的BRCA2突变有相当一部分被归类为意义未明突变。

本研究选取三个BRCA2错义VUS进行功能性状表征：c.5969 A > C (p.Asp1990Ala)位于BRC7结构域，c.3671G > A (p.Gly1224Asp)位于BRC2结构域，c.5459G > A (p.Cys1820Tyr)位于BRC5和BRC6之间的间隔区。这些区域在RAD51结合和同源重组修复中发挥关键作用。以已知致病性变异c.8167G > C (p.Asp2723His)作为致病性对照，野生型BRCA2作为功能参考。样本来源于K-MASTER项目的9,677例患者肿瘤基因组测序数据，以及具有强烈遗传性癌症怀疑（基于家族史）的韩国乳腺癌患者。

本研究采用的关键技术方法包括：利用BRCA2敲除的DLD-1结直肠癌细胞系作为实验模型，通过位点定向突变技术构建全长人源BRCA2 cDNA表达质粒，采用脂质体转染法将构建体导入细胞；运用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）进行细胞活力检测，评估顺铂处理和电离辐射后的细胞敏感性；使用X射线辐照仪进行辐射诱导DNA损伤检测；通过PARP抑制剂奥拉帕利处理评价药物敏感性；采用基于GFP的报告系统结合I-SceI内切酶诱导双链断裂，直接评估同源重组修复效率。

**K-MASTER队列中BRCA2意义未明变异的识别与分布**

对K-MASTER项目9,677例患者肿瘤基因组测序数据的分析显示，BRCA1变异见于737例（7.6%），BRCA2变异见于1,411例（14.6%）。按临床意义分类时，相当比例的检测变异被归类为意义未明变异。具体而言，BRCA2 VUS占分析总队列的7.04%。在BRCA2 VUS中，错义变异是最主要的突变类型，而致病性或可能致病性变异则更常与截断突变（包括移码和无义突变）相关。这一分布表明错义替换是韩国癌症人群中BRCA2变异解读不确定性的主要来源。肿瘤类型分析显示，BRCA2 VUS最常见于乳腺癌，其次为结直肠癌、胃癌、肺癌、头颈部癌和卵巢癌。

**BRCA2 VUS的选择与功能分析**

为优先确定功能评估的候选变异，研究人员根据K-MASTER队列中的频率和与遗传性癌症提示性临床特征（包括家族史）的关联对BRCA2 VUS进行排序。在复发变异中，c.5969 A > C (p.Asp1990Ala)见于28例患者，变异等位基因频率接近50%，提示可能的生殖系起源。由于现有功能或临床证据支持良性分类，多个检测频率更高的变异被排除。因此，p.Asp1990Ala被选为代表性复发性BRCA2 VUS。此外，c.3671G > A (p.Gly1224Asp)和c.5459G > A (p.Cys1820Tyr)基于其在具有强烈乳腺癌或相关癌症家族史患者中的存在而被选中。所有三个选定变异均位于或邻近与RAD51结合和同源重组修复相关的BRC重复区域。

**选定BRCA2 VUS的保守性和结构分析**

六种物种BRCA2同源物的多序列比对显示，对应于p.Asp1990Ala、p.Gly1224Asp和p.Cys1820Tyr的氨基酸残基具有进化保守性。与RAD51-BRCA2复合物结构对齐的BRC重复三维结构模型显示，p.Asp1990Ala和p.Gly1224Asp预测存在异常残基突出和局部构象改变，而p.Cys1820Tyr则显示相对保守的结构特征。

**BRCA2野生型、致病性和VUS构建体在BRCA2缺陷细胞中的表达**

为评估各变异的功能影响，将编码野生型蛋白、已知致病性变异或各VUS的全长BRCA2构建体瞬时转染至BRCA2敲除DLD-1细胞。蛋白质免疫印迹分析证实野生型、致病性对照和所有三个VUS构建体转染细胞中均表达全长BRCA2蛋白。BRCA2表达水平在各构建体间相当，表明观察到的功能差异不太可能归因于蛋白质表达或稳定性的显著差异。

**顺铂诱导DNA损伤的差异性细胞反应**

野生型BRCA2表达细胞在顺铂暴露后呈现逐渐的剂量依赖性细胞活力降低，与完整的同源重组修复能力一致。相比之下，BRCA2敲除细胞对顺铂表现出显著敏感性。表达致病性对照变异的细胞显示出与BRCA2敲除细胞相似的顺铂敏感性。值得注意的是，表达BRCA2 p.Asp1990Ala的细胞也表现出增高的顺铂敏感性，与致病性对照和敲除细胞的反应密切相似，其半数抑制浓度（IC₅₀）值显著低于野生型BRCA2。相反，表达BRCA2 p.Gly1224Asp或p.Cys1820Tyr的细胞在测试的顺铂浓度范围内保持较高的细胞活力，剂量-反应曲线与野生型BRCA2表达细胞相当。

**BRCA2 p.Asp1990Ala对电离辐射的敏感性增高**

野生型BRCA2表达细胞对低剂量辐射表现出相对抗性，随剂量增高和时间延长存活逐渐下降。BRCA2敲除细胞则表现出明显的辐射敏感性。表达致病性对照变异的细胞显示与敲除细胞相似的存活曲线。重要的是，表达BRCA2 p.Asp1990Ala的细胞在辐射暴露后也显示降低的存活，与致病性对照密切平行。由于p.Gly1224Asp和p.Cys1820Tyr表达细胞在顺铂检测中表现野生型样行为，未进一步进行辐射检测。

**BRCA2 p.Asp1990Ala对PARP抑制的敏感性增高**

野生型BRCA2表达细胞对奥拉帕利表现出相对抗性，而BRCA2敲除细胞则表现出显著降低的细胞活力。表达致病性对照变异的细胞显示与敲除细胞相当的奥拉帕利敏感性。同样，表达BRCA2 p.Asp1990Ala的细胞也表现出对奥拉帕利的敏感性增高，其IC₅₀值更接近于致病性和敲除细胞而非野生型对照。

**GFP报告系统评估显示BRCA2 p.Asp1990Ala同源重组修复受损**

表达野生型BRCA2的细胞显示强劲的GFP信号，表明有效的HR介导修复。BRCA2敲除细胞则显示极低的GFP阳性率，反映了HR缺陷。表达致病性对照变异的细胞显示显著降低的GFP信号。值得注意的是，表达BRCA2 p.Asp1990Ala的细胞也显示GFP阳性细胞数显著减少，与致病性对照相当。相反，表达p.Gly1224Asp或p.Cys1820Tyr的细胞中GFP信号强度与野生型BRCA2相当。

在讨论部分，研究人员指出本研究源于肿瘤下一代测序时代日益常见的临床相关困境：识别出强烈提示生殖系起源但仍是意义未明变异的BRCA2变异。韩国大规模基因组筛查工作已证明，通过肿瘤测序检测到的相当一部分BRCA2变异被指定为VUS，且常出现于接近50%的变异等位基因频率，这一模式高度提示生殖系遗传。当前ACMG/AMP指南下的VUS解读仍然具有挑战性，由于参考数据库和人群频率数据主要来源于白种人群，很多亚洲队列中识别的变异无法满足致病或良性的标准，因此仍为VUS。

本研究聚焦于韩国癌症人群中复发性识别且与遗传性乳腺癌提示性临床特征相关的BRCA2错义VUS的功能性状表征。鉴于BRCA2-RAD51相互作用在同源重组修复中的关键作用，位于或邻近BRC重复区域的变异被优先进行实验评估。在三个分析的变异中，BRCA2 p.Asp1990Ala在多个检测中表现出一致的DNA修复功能受损，而p.Gly1224Asp和p.Cys1820Tyr在使用的实验系统中未显示功能损害。这凸显了BRCA2 missense变异之间显著的功能异质性，并说明了仅基于序列保守性、结构域位置或临床怀疑预测生物学影响的局限性。一些携带BRCA VUS的患者可能表现出更接近致病性变异携带者的治疗反应，特别是在PARP抑制剂治疗背景下，尽管当前临床指南不支持仅基于VUS状态进行单独治疗决策。

研究的局限性在于所有功能分析均在体外使用单一BRCA2敲除细胞系进行，可能无法完全再现肿瘤生物学或组织特异性环境的复杂性；瞬时转染可能引入表达水平变异性；未整合分离分析和纵向临床结局数据，限制功能发现与患者水平表型之间的直接关联，特别是详细的治疗反应信息和遗传性信息在队列中未统一获得。

研究结论部分翻译如下：本研究为特定BRCA2 VUS的功能影响提供了重要见解，特别是在韩国人群中。研究结果表明，BRCA2 D1990A表现出受损的DNA修复能力，与致病性变异更为一致，而BRCA2 G1224D和BRCA2 C1820Y保持与野生型BRCA2相似的DNA修复功能。这些发现支持对BRCA2 VUS进行实验验证以辅助VUS再分类的重要性。需要进一步研究在临床环境中确认这些发现并探索其他VUS，最终增强个性化风险评估和患者照护。