具有增强轴突活动能力的人视网膜类器官来源的红/绿锥细胞前体细胞的鉴定与富集

《Stem Cell Research & Therapy》：Identification and enrichment of human retinal organoid-derived red/green cone-competent precursors with enhanced axon dynamics

摘要

背景

旨在恢复黄斑视力的细胞替代疗法需要大量具有合适内在特性的红/绿（长/中波长，即L/M）锥状光感受器，以便其能够功能性地整合到宿主视网膜中。最新研究显示，成熟的人类视网膜类器官中的锥状细胞能够产生与猕猴黄斑锥状细胞相当的光反应。然而，只有处于早期发育阶段的视网膜类器官中的锥状细胞前体才具备自我生成轴突的能力。因此，我们试图识别并筛选出那些具有更优异轴突生长特性的早期L/M锥状细胞前体，为未来的黄斑重建工作提供理想的供体细胞来源。

方法

我们构建了一种双功能L/M锥状细胞/杆状细胞报告基因载体（L/M-CRR），以便准确识别人类视网膜类器官中的早期L/M锥状细胞前体。为此，我们利用CRISPR/Cas9技术将tdTomato转基因与WA09 NRL^+/eGFP杆状细胞报告基因载体中的内源性THRB2启动子相连。在视网膜类器官的早期（第50天）和中期（第100天）发育阶段，我们通过实时荧光成像、免疫细胞化学和流式细胞术等多种方法对它们进行表征，随后通过荧光激活细胞分选和批量RNA测序分析，来确定这些早期L/M锥状细胞前体的独特分子特征。

结果

在视网膜类器官的整个发育过程中，由THRB2驱动的tdTomato荧光能够准确标记出L/M锥状细胞前体，不过随着L/M锥状细胞逐渐成熟，后期的视网膜类器官中荧光强度会下降。转录组分析显示，第50天经过分选的tdTomato⁺细胞中，与神经发育、轴突延伸与引导以及细胞迁移相关的基因表达显著升高，其中就包括一种编码细胞表面蛋白CD166/ALCAM的基因。通过使用抗CD166抗体进行磁激活细胞分选，我们可以成功筛选出那些具有高度轴突生成能力的早期L/M锥状细胞前体，这一过程可通过时间序列成像来验证。

结论

L/M-CRR载体有助于在视网膜类器官的早期到中期发育阶段准确识别并对其进行转录组分析，以了解L/M锥状细胞前体的特性。我们的研究还发现，CD166/ALCAM这一标志物可以用来独立识别并筛选出一部分具有适宜轴突动态特性的早期L/M锥状细胞前体，这类细胞更有利于整合到视网膜电路中。我们的研究首次揭示了人类早期L/M锥状细胞的发育规律，同时建立了一种方法，可用于分离出轴突生长能力更强的L/M锥状细胞前体，这类细胞有望用于治疗因光感受器退化而导致的中心视力丧失问题。