肝细胞癌中性粒细胞聚集自噬(aggrephagy)活性的单细胞空间图谱解析及其用于患者分层的五基因诊断模型

《Translational Oncology》：Single-cell spatial landscape of aggrephagy activity stratifies hepatocellular carcinoma neutrophils and delivers a 5-gene diagnostic panel for patient stratification

　　

背景：肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, LIHC）具有复杂的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME），其中肿瘤相关中性粒细胞（Tumor-Associated Neutrophils, TANs）表现出显著的可塑性。聚集自噬（aggrephagy，即选择性清除蛋白聚集体的自噬分支）在塑造中性粒细胞异质性与LIHC进展中的作用尚不清楚。方法：研究人员整合了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq，n=183,671个细胞）、空间转录组（spatial transcriptomics）及批量转录组数据集（TCGA, GSE39791）。将中性粒细胞（n=12,547）重新聚类为6个亚群，并通过UCell评分量化aggrephagy活性。分析包括拟时序轨迹（pseudotime trajectories）、细胞间通讯（cell–cell communication）、代谢评分及机器学习特征筛选，并行体外功能验证。结果：Aggrephagy活性在肿瘤组织中显著高于癌旁正常组织（P < 0.001），且具有细胞类型特异性，TANs为最富集的细胞群体之一。高aggrephagy中性粒细胞呈未分化状态、偏好肿瘤区富集且与转录组风险评分正相关。轨迹分析将其定位于早期分化分支，并通过CCL3–CCR1、SPP1–CD44及ANXA1–FPR1轴主导向基质细胞的信号传递。代谢上，高aggrephagy中性粒细胞显示炎症及上皮–间质转化（Epithelial–Mesenchymal Transition, EMT）程序增强，氧化磷酸化受抑。整合网络分析鉴定出五基因诊断模型（SQSTM1、WDFY3、DOCK4、CD177、LIMK2），在批量队列中表现良好（AUC 0.83–0.91）。其中LIMK2标记高互作中性粒细胞亚群，体外可促进肿瘤细胞增殖、存活、迁移与侵袭。结论：Aggrephagy与LIHC中具有促瘤特性且代谢重编程的中性粒细胞状态相关。以LIMK2为中心的基因模型为中性粒细胞亚群鉴定提供稳健框架，并为未来自噬及中性粒细胞靶向研究提供候选靶点。

本研究发表于《Translational Oncology》。

【研究背景】

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, LIHC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其高度异质的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）深刻影响疾病进展与治疗反应。中性粒细胞作为TME中最丰富的髓系免疫细胞，传统上被视为终末分化的同质群体，但近年单细胞证据揭示肿瘤相关中性粒细胞（Tumor-Associated Neutrophils, TANs）存在显著异质性，可极化为促瘤（N2样）和抗瘤（N1样）状态。聚集自噬（aggrephagy，选择性自噬的一个分支，通过自噬受体识别并清除泛素化蛋白聚集体以维持细胞内蛋白稳态）在肿瘤细胞中已被广泛研究，但其在单细胞水平如何关联中性粒细胞异质性、能否作为TAN亚群分类的分子标志以及在LIHC微环境中的空间分布特征均属未知。鉴于自噬与炎症信号密切交联，分析aggrephagy相关基因（aggrephagy-associated genes, AGGREPHAGY-ATGs）在TANs中的表达谱有望揭示新型功能亚群及中性粒细胞双向作用的分子基础。因此研究人员假设aggrephagy活性可作为LIHC中TAN功能亚群分类的信息性分子维度，并开展本研究以构建LIHC中性粒细胞单细胞自噬图谱并鉴定可转化的aggrephagy相关标志物组合。

【主要关键技术方法】

研究人员整合公开数据库获取TCGA-LIHC（374例肿瘤/50例配对癌旁）与GSE39791（72例肝癌/72例配对非肿瘤）批量转录组数据；收集GEO中scRNA-seq数据（GSE136103、GSE290925、GSE166635）共183,671个高质量细胞及空间转录组切片（GSE203612，Visium平台）。对中性粒细胞（FCGR3B⁺CSF3R⁺）单独提取再聚类获得6个亚群（N0–N5）。采用MSigDB中GOBP_AGGREPHAGY基因集（35个基因）通过AUCell、UCell、Seurat AddModuleScore及singscore四种算法计算aggrephagy活性并取UCell评分用于下游分析。应用CytoTRACE评估分化程度，Monocle 2重建拟时序轨迹，CellChat推断细胞–细胞通讯，hdWGCNA构建共表达网络。采用七种机器学习算法（决策树、随机森林、GBM、Boruta、ABESS、XGBoost、LASSO）交叉筛选特征基因并经外部独立队列验证。体外以肝癌细胞系Hep 3B和Hep G2进行LIMK2 siRNA敲低，通过CCK-8、流式细胞术凋亡检测及Transwell迁移侵袭实验进行功能验证。

【研究结果】

构建单细胞图谱并注释九种肝脏微环境细胞类型

研究人员经质控与Harmony批次校正获得183,671个细胞，基于经典标志物注释为9大类：肝细胞（ALB⁺）、成纤维细胞（DCN⁺）、内皮细胞（PECAM1⁺）、T/NK细胞（CD3D⁺NKG7⁺）、B细胞（CD79A⁺）、浆细胞（JCHAIN⁺）、髓系细胞（LYZ⁺）、中性粒细胞（CSF3R⁺FCGR3B⁺）及肥大细胞（GATA2⁺），中性粒细胞进一步细分6个亚群用于后续分析。

多算法验证显示aggrephagy活性在肿瘤中升高且具有细胞类型特异性

在TCGA批量队列中aggrephagy评分肿瘤组织显著高于癌旁（P＜0.001），单细胞水平四种算法评分一致性良好（UCell与AUCell Pearson r=0.92）。UCell评分显示肿瘤vs癌旁差异在肝细胞和T/NK中最显著，高活性细胞集中分布于肿瘤区域并呈簇特异性；空间转录组叠加显示高aggrephagy信号富集于门管区–肿瘤边界。

高aggrephagy中性粒细胞亚群呈未分化表型、肿瘤富集且与TRS正相关

将中性粒细胞按aggrephagy评分三分位分为高（HAS）、中（DTAS）、低（LAS）组。CytoTRACE显示HAS分化程度最低（P＜2.2×10^-16），aggrephagy评分与分化度负相关（r=-0.13, P＜1×10^-26）；Monocle 2拟时序将HAS置于早期分化分支。MiloR与Ro/e分析表明HAS富集于肿瘤组织而LAS富集于正常组织；scPagwas分析显示aggrephagy评分与转录组风险评分（Transcriptomic Risk Score, TRS）正相关，提示高aggrephagy对应高危转录特征。

高自噬中性粒细胞重塑代谢与信号网络，促炎–促纤维化轴占主导

CellChat分析显示HAS中性粒细胞主要通过CCL3–CCR1、SPP1–CD44和ANXA1–FPR1轴向内皮细胞和成纤维细胞发送信号（占权重＞70%）。GSVA显示HAS上调Hallmark通路"Inflammatory Response""IL6–JAK–STAT3""Epithelial–Mesenchymal Transition (EMT)"，下调"Oxidative Phosphorylation""Fatty Acid Metabolism"；KEGG代谢分析示HAS富集糖酵解、磷酸戊糖途径（Pentose Phosphate Pathway, PPP）及精氨酸–脯氨酸代谢，氧化磷酸化受抑。

hdWGCNA鉴定aggrephagy协同模块M1及421个核心基因

软阈值幂β=9构建加权共表达网络得6个模块（M1–M6），模块特征值（Module Eigengene, ME）显示M1（312基因）在HAS中上调最显著且与aggrephagy活性协调最佳。取HAS vs LAS差异基因（|log₂FC|＞0.58, FDR＜0.05）与各模块交集获421个核心基因，富集于NOD样受体信号、自噬及中性粒细胞脱颗粒。

机器学习结合交叉验证鉴定可解释82% aggrephagy评分变异的六基因特征

Spearman相关筛选后与UCell评分显著相关的22个基因中，七种机器学习算法共同选出SQSTM1、WDFY3、CD177、TANK、QKI、IRAK2六个共识基因，其表达可解释82%的aggrephagy评分方差。

五基因诊断模型在肿瘤组织中高表达，LIMK2⁺中性粒细胞驱动促炎–促纤维化信号

最终诊断panel为SQSTM1、WDFY3、DOCK4、CD177、LIMK2，在TCGA及GSE39791中肿瘤组织表达均高于癌旁，各基因AUC分别为0.91、0.89、0.87、0.85、0.83。空间上高表达细胞集中于肿瘤核心区并与高aggrephagy评分共定位。按LIMK2表达分群，LIMK2⁺中性粒细胞向外通讯增加1.8倍，主导SPP1–(ITGAV+ITGB1)、CCL3–CCR1及ANXA1–FPR1轴，LIMK2^-亚群几无此互作。

LIMK2功能验证证实其在HCC中的致癌作用

临床标本qRT–PCR示LIMK2在肝癌组织显著高于配对癌旁；Hep 3B/Hep G2中siRNA敲低LIMK2（敲减＞70%）后，CCK-8示增殖受抑，流式示凋亡增加，Transwell示迁移与侵袭能力下降，证实LIMK2促进HCC细胞增殖、存活及转移能力。

【讨论与结论】

讨论部分指出：本研究首次在LIHC中整合单细胞与空间转录组系统刻画了aggrephagy关联的中性粒细胞异质性，高aggrephagy TANs呈未分化、代谢重编程（糖酵解↑/OXPHOS↓）、富集于门管区–肿瘤边界并通过CCL3–CCR1、SPP1–CD44、ANXA1–FPR1强化基质通讯，符合促瘤N2样特征。Aggrephagy在此应被理解为一协同性状态标志而非已证实的单向上游驱动因子，其可能通过维持蛋白稳态与代谢适应支持未成熟TAN在肿瘤生态位中的适应性存活。五基因panel经七算法交叉筛选及独立队列验证有一定抗过拟合保障，但尚需多中心前瞻验证及蛋白水平检测开发。LIMK2作为Rho/ROCK–cofilin通路激酶可能通过调控肌动蛋白细胞骨架影响自噬体运输及极性分泌，是连接aggrephagy与中性粒细胞–基质互作的候选效应分子。研究局限性包括缺乏原代TAN直接aggrephagy扰动、横断面设计、10×平台低丰度转录本捕获限制及公共数据种族多样性有限。

结论（翻译）：Aggrephagy活性可将LIHC中性粒细胞划分为功能迥异的高、低自噬状态，二者在空间、代谢及临床上均存在显著差异。经严格验证的五基因标签（SQSTM1、WDFY3、DOCK4、CD177、LIMK2）捕捉此二分特征且AUC≥0.83，为患者分层提供可直接转化的生物标志物。通过确定自噬为中性粒细胞重编程的候选关联轴，本研究为今后在肝细胞癌中评估联合免疫治疗的自噬调控策略提供了依据；上述发现进一步支持在富含高aggrephagy TAN的LIHC中检测标志物引导的中性粒细胞重编程，作为潜在手段以改善治疗效果。