《Translational Oncology》：Establishment of a clear cell renal cell carcinoma organoid cohort integrated into the UroCCR clinical database: A feasibility study
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透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）类器官为个性化医学提供了有前景的平台，使得针对患者特异性的治疗策略成为可能。然而，要优化其临床应用，仍需解决若干挑战。提高建立成功率、优化培养条件以及确保患者来源肿
透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）类器官为个性化医学提供了有前景的平台，使得针对患者特异性的治疗策略成为可能。然而，要优化其临床应用，仍需解决若干挑战。提高建立成功率、优化培养条件以及确保患者来源肿瘤类器官（Patient-Derived Tumor Organoids, PDTO）忠实再现原始肿瘤特征是关键优先事项。整合基质和免疫组分可能增强其对治疗反应的预测准确性，而高通量方法学有助于大规模应用。克服这些挑战对于将ccRCC类器官从实验模型转化为临床相关工具至关重要，最终将有助于生物标志物发现、药物测试和精准肿瘤学的进步。
**研究背景与问题提出**
在法国，肾癌位居常见恶性肿瘤第六位，每年新增约15,300例，导致超过5,500例死亡。透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）是最主要的组织学亚型，约占全部病例的75%。尽管早期或局部进展期ccRCC预后良好，五年生存率可达90%，但约30%患者会发展为转移性疾病，此时生存率骤降至10%，即使采用靶向治疗（Tyrosine Kinase Inhibitor, TKI）和免疫治疗（Immunotherapy, IO）取得了一定进展。目前转移性ccRCC的一线治疗方案为双免疫联合（IO-IO）或免疫联合酪氨酸激酶抑制剂（IO-TKI）。然而，由于显著的肿瘤异质性，约25%患者对一线治疗无反应，迄今尚无有效的预测性或治疗诊断性生物标志物。这些局限性凸显了对改进治疗策略的迫切需求。
个性化医学根据个体肿瘤特征定制治疗方案，展现出良好前景，但其进展受限于缺乏能够准确再现ccRCC生物学并预测治疗反应的可靠临床前模型。传统二维（2D）细胞培养因平面非生理学环境而临床相关性受限；小鼠异种移植模型虽长期用于TKI研究，但存在伦理和成本问题，且不利于免疫治疗研究。相比之下，患者来源肿瘤类器官（Patient-Derived Tumor Organoids, PDTO）能更好地再现肿瘤形态、异质性和治疗反应。尽管PDTO模型已在头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌等多种肿瘤中成功建立，并有系列研究探索其在临床中的应用，但ccRCC领域仍然探索不足，已发表的ccRCC PDTO建立方案较少，且建立率变异较大。此外，多数已发表方案主要聚焦培养可行性与表征，与结构化临床数据的整合有限，尚未被整合入与临床数据相关联的生物库中。基于此，本研究旨在评估在UroCCR法国多中心临床数据库框架内，从手术标本中生成ccRCC PDTO的可行性，并表征其初始形态学和免疫组织化学特征。
**关键技术方法概述**
本研究纳入2023年11月至2024年3月期间在卡昂大学医院行根治性或部分肾切除术的成人ccRCC患者。排除标准包括：肿瘤<4 cm（cT1a）、囊性病变、既往免疫治疗或酪氨酸激酶抑制剂治疗史、以及非ccRCC组织学类型。手术标本立即送至病理实验室，分配三份样本用于PDTO培养、三份镜像样本用于组织学分析、两份保存至肿瘤库（INNOVABIO）。PDTO样本经酶解消化后，采用GentleMACS OctoDissociator
?进行机械-酶解离解，过滤后计数并重悬于含不同细胞外基质（Matrigel、BME2或I型胶原）的培养基中，以10,000-15,000细胞/50 μL滴种于24孔板。研究人员测试了七种培养条件，在基础培养基成分（Advanced DMEM vs. Advanced DMEM/F12）、细胞外基质类型（Matrigel vs. I型胶原）和生长因子补充（EGF、FGF、B27等）三个维度进行优化。条件5和6专门用于冻存样本，条件7采用气-液界面（Air-Liquid Interface, ALI）培养法。PDTO传代采用机械吹打联合TrypLE
? Express酶解。组织学分析采用苏木精-伊红（H&E）染色，免疫组织化学检测碳酸酐酶IX（Carbonic Anhydrase 9, CA-IX）和细胞角蛋白7（Cytokeratin 7, CK7）表达，在Ventana Benchmark ULTRA全自动系统上进行，使用S360 NanoZoomer
?扫描仪获取图像。
**研究结果**
**患者与肿瘤特征**：共纳入18例患者，中位年龄73岁，男女比例1.6:1。17例行肾切除术（53%全切，47%部分切除），最终12例（70.0%）经组织病理学确认为ccRCC，中位肿瘤分期pT1b，中位ISUP/OMS分级2级，16.7%诊断时即存在转移。
**PDTO培养建立与优化**：在七种测试条件中，PDTO成功建立于12/18例（66.7%），其中9例来自新鲜样本，3例来自冻存样本。PDTO中位培养时间52天，平均传代2次。条件2（含EGF、FGF、肝素和B27补充剂）效果最佳，12例中5例成功（41.7%）；条件1、5、6各2例成功（16.7%）；条件3仅1例成功（8.3%）；条件4和7未能维持生长超过数日。ALI培养因I型胶原基质不透明无法可靠监测、胶原凝胶黏稠导致传代困难、以及每样本可用细胞数有限等多重技术限制而早期终止。
**类器官形态学特征**：显微镜检查显示两种主要PDTO结构：囊性（cystic）和实性（solid）。囊性类器官具有中央腔隙，周围环绕上皮层，类似肾小管；实性类器官表现为致密、无序的生长方式。PDTO随时间扩展，囊性结构直径从第1代的平均300 μm增至第2代的500 μm；实性PDTO则随传代减少，可能由于细胞活力下降。中心坏死区域常见，推测因快速增殖和营养供应不足所致。
**免疫组织化学表征**：对12例成功建立的PDTO中的5例（42%）进行IHC分析。PDTO显示与相应原发肿瘤大体一致的形态学特征。CA-IX阳性支持其ccRCC表型，但CK7表达在类器官间存在变异，且有时与原发肿瘤 profile 不一致。例如，R23.003原发肿瘤CA-IX阳性、CK7阴性，而对应PDTO呈CA-IX强阳性伴意外CK7阳性，提示培养诱导的可塑性；R24.007原发肿瘤CA-IX阳性、CK7阴性，PDTO呈CA-IX中度表达伴CK7强阳性，可能提示向其他肾癌亚型分化；R24.012原发肿瘤CA-IX阳性、CK7阴性，PDTO CA-IX弱表达、CK7强表达，提示去分化；R24.014原发肿瘤CA-IX阳性、CK7阴性，PDTO CA-IX强表达、CK7弱而局灶表达。
**讨论与结论**
本研究的主要贡献在于将ccRCC类器官生成整合至UroCCR框架内。UroCCR是法国国家级多中心前瞻性数据库，涵盖超过60个参与中心的20,000余例患者，标准化收集了临床、病理和生存数据。通过将类器官培养与这一成熟基础设施相连接，该研究为将来开展类器官药物敏感性谱或分子特征与真实世界患者结局相关联的辅助研究奠定了基础。并行生物库策略——包括用于组织学、冻存保存和分子分析的镜像样本——进一步确保了类器官发现可与匹配肿瘤组织交叉验证。
与本研究66.7%的建立率相比，既往文献报道ccRCC PDTO建立率为67-88%，本研究较低的42%最终可扩展培养率可能源于：（i）队列中肿瘤较小（50%标本为pT2或更小）；（ii）ccRCC异质性导致的细胞浓度变异；（iii）冻存样本可能损害细胞活力；（iv）周围组织非肿瘤细胞污染；（v）多条件测试分散了每条件的细胞投入。为优化培养，研究人员提出改进策略包括改良解离方法、适应性培养支持以及红细胞裂解等技术。
研究人员指出，标准化培养方法和选择最优培养基组成对改进肿瘤类器官模型至关重要。尽管遵循多种方案，本研究未确定理想培养基。A83-01（TGF-β抑制剂）和R-spondin1（Wnt通路激活剂）应避免使用，因其促进正常上皮细胞增殖；而Y-27,632二盐酸盐（ROCK-1抑制剂）等凋亡抑制剂对细胞存活至关重要。当前方案需约63天（三代，每代间隔21天）才能获得稳定的培养扩增，显著延长了培养时间，延迟了分子分析和治疗测试。未来研究应探索更早传代的替代方案，或采用肿瘤外植体培养以加速流程。
针对PDTO形态学，ccRCC来源类器官主要呈现囊性和实性两种形式。Li等曾认为囊性形成与缺乏SB-202,190（p38 MAP激酶选择性抑制剂）有关，但本研究系统加入SB-202,190后囊性PDTO仍然存在。IHC表征限于CA-IX和CK7，未来应纳入PAX-8、CD10等更全面的标志物。值得注意的是，部分PDTO出现CK7过表达，可能反映多次传代后的渐进性去分化或少数亚克隆扩增，NOTCH抑制剂可能预防此现象。
当前PDTO模型的重大局限在于缺乏免疫细胞，无法评估免疫治疗反应，而ccRCC治疗策略恰恰靶向肿瘤微环境（包括免疫浸润和血管系统）。潜在解决方案包括与自体基质细胞共培养、外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）或肿瘤内淋巴细胞来源的T淋巴细胞共培养以评估免疫检查点抑制剂（如PD-1、PD-L1、CTLA-4）疗效，以及整合微流控系统实现优化气体交换或与内皮细胞共培养以构建血管系统。随着这些技术成熟，肿瘤PDTO有望从实验工具转变为精准肿瘤学的核心组成部分。
**研究结论**：透明细胞肾细胞癌类器官为个性化医学提供了有前景的平台，使针对患者特异性的治疗策略成为可能。然而，要优化其临床应用，仍需解决若干挑战——提高建立成功率、优化培养条件、确保PDTO忠实再现原始肿瘤特征是关键优先事项。整合基质和免疫组分可能增强其对治疗反应的预测准确性，而高通量方法学有助于大规模应用。克服这些挑战对于将ccRCC类器官从实验模型转化为临床相关工具至关重要，最终将有助于生物标志物发现、药物测试和精准肿瘤学的进步。
