《Food Chemistry: X》：Astaxanthin and naringin synergistically promote proliferation and myogenic differentiation of piscine satellite cells via mTOR signaling
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细胞培养鱼肉被认为是替代传统渔业的可行方案，可提供可持续且可控的高品质蛋白质来源。其生产依赖于体外肌生成过程，包括肌肉卫星细胞的培养与分化，随后对成熟肌肉细胞进行加工以获得理想的风味与质地。大黄鱼（Larimichthys crocea）是东亚地区广泛养殖的重
细胞培养鱼肉被认为是替代传统渔业的可行方案，可提供可持续且可控的高品质蛋白质来源。其生产依赖于体外肌生成过程，包括肌肉卫星细胞的培养与分化，随后对成熟肌肉细胞进行加工以获得理想的风味与质地。大黄鱼（Larimichthys crocea）是东亚地区广泛养殖的重要经济海水鱼类，但由于环境污染和过度捕捞，野生大黄鱼资源日益枯竭。从该物种分离的鱼类卫星细胞（PSCs）具有成肌潜能，包括增殖和分化为肌管并最终形成肌纤维的能力，因此可作为研究肌肉生长和优化体外细胞培养鱼肉生产策略的理想细胞模型。目前研究的重点在于实现肌肉卫星细胞的体外大规模扩增与高效分化，但长期培养过程中这些细胞的增殖效率和分化能力随传代次数增加而逐渐下降，严重制约了其规模化应用。同时维持增殖、保留分化潜能并保持细胞稳态的安全有效策略仍然有限。肌肉卫星细胞的命运受细胞内信号通路和代谢状态的严格调控，其中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在协调细胞生长、增殖和分化中起核心作用，通过整合营养可利用性和能量信号发挥作用。此外，线粒体功能和氧化还原稳态对细胞活性至关重要，活性氧（ROS）的过度积累会破坏增殖和分化，并干扰mTOR信号。因此，通过mTOR介导的线粒体功能和氧化还原平衡调控可能对促进肌肉卫星细胞的体外扩增至关重要。与哺乳动物卫星细胞相比，鱼类卫星细胞生长发育的调控网络研究尚显不足。现有证据表明，PSCs的分化依赖于信号通路抑制剂，如转化生长因子-β受体1（TGF-βR1）抑制剂RepSox，但此类合成添加剂的食品安全性尚不明确。因此，探索安全、经济有效的生物活性物质以维持或增强肌肉卫星细胞在长期培养中的表现至关重要。虾青素（Ast）是一种来源于微藻和甲壳类壳体的类胡萝卜素，被公认为安全的食用物质，获批作为功能性食品添加剂。其强效抗氧化活性可保护线粒体膜免受ROS诱导的氧化损伤，并能通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/mTOR（PI3K/AKT/mTOR）通路促进虹鳟鱼的肌肉生长。柚皮苷（Nar）是一种主要存在于葡萄柚和其他柑橘类水果中的黄酮类化合物，具有多种药理作用。Nar可通过加速细胞周期进程促进细胞增殖，并通过PI3K/AKT信号通路对抗凋亡。鉴于PSCs长期培养的特征是累积的氧化应激抑制mTOR活性，Ast和Nar可能发挥协同作用：Ast通过其抗氧化活性缓解氧化还原障碍，从而减轻对mTOR的抑制；同时Nar直接驱动下游增殖和分化信号。这种双重机制预期可产生比单一化合物更强的效果。本研究中，研究人员系统评估了三种特定信号通路调节剂——TGF-βR1抑制剂SB431542、mTOR激活剂MHY1485和糖原合成酶激酶3β（GSK3β）抑制剂CHIR99021对PSCs增殖和成肌分化的影响，发现MHY1485效果最佳。通过分子对接预测多种天然产物与mTOR的结合模式，基于对接结果和后续细胞活力检测，选择Ast和Nar作为能够结合mTOR并对细胞活力产生积极作用的候选天然产物。随后评估了Ast和Nar单独或联合使用作为合成化合物替代品的可行性，并考察了其对PSCs增殖、成肌分化和线粒体功能的影响，探讨了mTOR信号通路的参与。
本研究聚焦于细胞培养鱼肉生产中的关键技术瓶颈——鱼类卫星细胞（PSCs）体外扩增过程中的增殖效率下降与分化能力衰退问题，旨在探索安全、高效的天然产物替代策略以优化PSCs的培养体系。
研究背景方面，随着传统渔业资源日益枯竭和环境污染加剧，细胞培养鱼肉作为可持续的高品质蛋白质来源备受关注。PSCs是从大黄鱼（Larimichthys crocea）分离得到的肌肉卫星细胞，具有成肌潜能，是细胞培养鱼肉生产的理想种子细胞。然而，PSCs在长期体外培养过程中，因频繁传代和批次差异，出现干性维持障碍、增殖与分化效率降低、甚至衰老凋亡等问题。目前虽可通过合成小分子调节剂（如TGF-βR1抑制剂、mTOR激活剂、GSK3β抑制剂等）改善细胞性能，但这些化合物存在潜在食品安全隐患，限制了其在食品生产中的实际应用。因此，开发安全、经济有效的天然生物活性物质成为迫切需求。Ast作为一种安全的食用类胡萝卜素，具有强效抗氧化活性；Nar作为柑橘类黄酮，可促进细胞增殖并对抗凋亡。研究人员推测两者可能通过协同作用激活mTOR信号通路，从而促进PSCs的增殖与分化。
该研究发表于《Food Chemistry: X》，其重要意义在于首次提出了一种基于食品级天然产物组合的PSCs扩增策略，为细胞培养鱼肉的规模化生产奠定了理论基础，同时降低了对合成化学试剂的依赖，提升了食品安全性。
在技术方法层面，研究人员从3尾6月龄大黄鱼背肌分离PSCs，经免疫荧光鉴定纯度后用于实验。研究首先通过CCK-8法和免疫荧光比较SB431542、MHY1485、CHIR99021三种合成化合物对PSCs增殖的影响；利用BIOVIA Discovery Studio进行分子对接分析配体与mTOR蛋白（PDB ID: 4JSV）的结合模式。基于对接结果和细胞活力筛选，确定Ast（1 μM）和Nar（50 nM）为最优浓度组合，并通过SynergyFinder网站基于Bliss、HSA和ZIP三种模型进行协同效应分析。研究采用EdU染色、流式细胞术检测细胞周期与凋亡，JC-1荧光探针检测线粒体膜电位（ΔΨm），MitoSOX Red检测线粒体超氧化物，DCFH-DA检测细胞内ROS水平。成肌分化方面采用Giemsa染色观察肌管形态，Western blot检测增殖标志物（Ki67、Cyclin家族、p21）、干性标志物（Pax7）、成肌调节因子（MyoD1、MyoG）和肌球蛋白重链（MyHC）等蛋白表达。机制验证上，使用100 nM雷帕霉素（Rap）预处理24 h阻断mTOR通路，对比分析Ast+Nar联合处理的效果变化。
研究结果部分，研究按照以下方面展开：
**合成化合物对PSCs增殖的影响**：通过CCK-8法和免疫荧光检测，研究发现10 nM-1 μM SB431542处理24 h可显著提高PSCs活力，但48 h效果不显著；10 nM-1 μM MHY1485和CHIR99021处理48 h显著促进细胞活力，其中MHY1485效果最佳。Ki67免疫荧光显示MHY1485组的Ki67阳性率是SB431542组的4.89倍、CHIR99021组的2.79倍。流式细胞术分析表明，MHY1485和CHIR99021使G1期细胞比例从67.2%±2.77%分别降至57.7%±2.06%和60.3%±3.58%，S期比例则从17.8%±1.80%升至28.4%±1.37%（MHY1485组）。该结果说明mTOR激活剂MHY1485对PSCs增殖的刺激作用最强。
**合成化合物对PSCs成肌潜能的调控**：免疫荧光显示MHY1485处理显著提高了Pax7和MyoD1的表达水平，Pax7荧光强度分别是SB431542组和CHIR99021组的5.66倍和2.82倍，MyoD1荧光强度分别为4.16倍和2.53倍。Western blot结果一致。分子对接分析显示MHY1485与mTOR蛋白活性位点结合较强（预测结合能：-26.9848 kcal/mol），通过TRP1456、GLU1457和ARG1665形成关键氢键相互作用。该发现表明MHY1485在维持PSCs干性和增强成肌特性方面效果最突出。
**Ast与Nar协同促进PSCs增殖**：CCK-8筛选显示1 μM Ast和50 nM Nar分别在各自浓度范围内促进细胞活力效果最显著，故选作后续实验浓度。联合处理组细胞活力显著高于单药组。生长曲线和倍增时间测定进一步证实联合组的促增殖效应。基于Bliss、HSA和ZIP模型的协同分析显示协同分数分别为11.092、1.219和11.143，Bliss和ZIP模型支持协同效应。与合成化合物对比，Ast+Nar组的Ki67阳性率高于MHY1485组；EdU染色显示仅联合处理显著增加EdU阳性细胞比例。上述结果表明Ast与Nar联合具有协同促增殖作用。
**Ast与Nar协同加速细胞周期进程并延迟PSCs凋亡**：流式细胞术显示Ast+Nar组G1期细胞比例明显降低，S期比例升高。Western blot检测G1-S-G2期关键调控蛋白，发现MHY1485、Ast、Nar及Ast+Nar均显著上调S期调控因子Cyclin A表达；MHY1485和Ast+Nar刺激Cyclin D1达相似水平，均显著高于Ast和Nar单独处理；Cyclin E1结果类似，表明联合处理协同启动DNA复制。p21表达趋势相反，MHY1485和Ast+Nar显著抑制p21蛋白表达。凋亡检测显示Ast+Nar组细胞凋亡率较对照组显著降低。上述结果证实Ast与Nar联合可通过加速细胞周期进程和抑制凋亡促进PSCs增殖。
**Ast与Nar协同降低ROS并改善线粒体功能**：JC-1荧光探针检测显示，对照组PSCs红色荧光弱、绿色荧光强，表明体外培养过程中出现一定线粒体损伤；MHY1485、Ast、Nar及Ast+Nar处理不同程度提高线粒体膜电位，联合处理效果优于单药。MitoSOX Red染色显示各处理均显著降低线粒体超氧化物水平，MHY1485和Ast+Nar效果最显著。DCFH-DA检测显示Ast+Nar和Ast单独处理均显著降低细胞内ROS水平，提示Ast增强了Nar清除ROS的能力。这些数据表明Ast与Nar联合通过提高线粒体膜电位、降低线粒体超氧化物水平缓解线粒体功能障碍，并通过降低ROS水平改善氧化还原稳态。
**Ast与Nar协同促进成肌分化**：研究人员建立了PSCs分化流程：生长培养基培养2天后换用含天然产物的分化培养基，第4天以1:2比例添加生长和分化培养基混合液，第6天检测终末成肌分化指标。免疫荧光显示Ast或Nar单独处理增加Pax7和MyoD1荧光强度，联合处理效果更强；Western blot证实Pax7和MyoD1蛋白表达显著升高。明场观察显示Ast+Nar组和MHY1485组PSCs分化旺盛，形成 elongated 且丰富的肌管，而单药组肌管数量少且短。Giemsa染色表明MHY1485通过增加肌管数量促进成肌分化，Ast+Nar具有相当效果。终末分化标志物MyoG和MyHC的Western blot检测显示，MHY1485或Ast+Nar处理均显著上调这些蛋白表达。上述结果证明Ast与Nar联合可维持成肌特性并增强肌管形成能力。
**Ast与Nar联合效应由mTOR信号通路介导**：分子对接预测Ast与mTOR靶蛋白结合极强（预测结合能-48.7095 kcal/mol），通过LYS1662形成氢键稳定结合；Nar显示中等亲和力（-15.1053 kcal/mol），与ASP1632形成氢键。三种配体在同一预设mTOR催化球内对接，结构比对显示Nar与MHY1485配体质心距离1.20 ?，Ast与MHY1485距离4.93 ?，表明三者占据同一口袋，Nar与参考构象基本重叠，Ast位于邻近亚位点。Western blot检测显示MHY1485和Ast+Nar显著增加PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平；值得注意的是，Ast+Nar产生的p-PI3K和p-AKT上调幅度大于任一单药组，mTOR磷酸化模式与AKT一致。这些结果提示Ast与Nar协同增强mTOR通路关键蛋白的磷酸化水平。
**mTOR信号与Ast+Nar促进增殖和分化的关联**：为阐明mTOR通路在Ast和Nar促增殖中的作用，研究人员使用100 nM Rap阻断该通路。Rap降低了PSCs中p-AKT、p-mTOR和p-p70 S6K的蛋白表达，但不影响总蛋白表达。Rap+Ast+Nar组中p-AKT、p-mTOR和p-p70 S6K水平显著低于Ast+Nar组。细胞数量统计显示Rap显著减弱了Ast和Nar诱导的细胞数量增加。细胞周期蛋白分析表明，Rap诱导的Cyclin D1和Cyclin E1下调可被Ast和Nar添加所挽救。在成肌分化方面，明场和Giemsa染色结果显示Rap+Ast+Nar组较Ast+Nar组肌管形成明显减少；成肌分化标志物蛋白表达分析进一步证实此结果。因此，Ast与Nar联合促进肌母细胞增殖和分化的作用部分依赖于mTOR通路。
**mTOR信号与Ast+Nar改善线粒体功能的关联**：为明确Ast和Nar改善线粒体功能障碍的作用是否与mTOR信号通路相关，研究人员使用特异性mTOR抑制剂Rap进行实验。JC-1结果显示，Rap+Ast+Nar组的聚合物/单体荧光比值较Ast+Nar组显著降低。Rap部分逆转了Ast+Nar降低ROS水平的效果。类似地，Rap部分阻断了Ast+Nar对线粒体功能的保护作用，表现为逆转线粒体超氧化物水平的降低。
在讨论部分，研究人员首先阐述了细胞培养鱼肉作为新兴产业的背景意义，指出PSCs作为种子细胞的重要性及其长期体外培养中的局限性。研究比较了靶向三种关键信号通路的合成调节剂，发现mTOR激活在调控PSCs增殖和成肌特性中起决定性作用，这凸显了鱼类与哺乳动物之间在物种特异性调控上的差异——哺乳动物成肌细胞增殖常通过Wnt调控，而PSCs更依赖mTOR活性。分子对接分析表明Ast和Nar占据与MHY1485相同的mTOR结合口袋，为后续机制研究提供了结构基础。
研究人员进一步讨论了mTOR作为G1/S期转变的驱动因子，通过转录和翻译控制细胞周期蛋白及细胞周期蛋白依赖性激酶，在肌肉干细胞从静息状态重新进入细胞周期以促进组织生长修复中起关键调控作用。天然黄酮类如Nar可上调细胞周期蛋白表达并调节细胞内钙以促进成肌细胞增殖；类胡萝卜素如Ast可增强间充质和肌肉前体细胞的增殖。本研究中Ast和Nar协同减少G1期细胞群体、升高S期调控因子（Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E1）、抑制细胞周期抑制因子p21，为PSCs的快速体外扩创造有利条件，凸显了天然生物活性物质 створ组合优于单一化合物应用的特殊优势。
关于成肌分化，研究人员阐述了骨骼肌组织形成过程中，成熟成肌细胞必须经历分化、迁移、排列和融合形成肌管的复杂过程，由Pax7和成肌调节因子的序贯激活所调控。Ast和Nar协同促进肌管形成，上调MyoD1、MyoG和MyHC表达，证明了其促进成肌分化的潜力。在线粒体功能与氧化还原稳态方面，Ast和Nar联合在维持线粒体膜电位、降低线粒体超氧化物和细胞内ROS方面的效果优于单一化合物或合成激活剂MHY1485，表明两者具有互补的保护作用。
机制探讨中，研究人员指出mTOR作为肌源性承诺的关键驱动因子，通过放大胞外信号调控细胞命运决定，同时也是线粒体功能和成肌细胞分化的重要调节者。Ast和Nar联合协同激活mTOR信号，与增强的细胞增殖、成肌分化和改善的线粒功能相关。Rap的部分逆转作用表明mTOR信号虽发挥重要作用，但可能无法完全解释所有观察到的效应，提示其他信号通路也可能参与介导。研究人员特别提及前期研究表明Nar通过Wnt信号通路促进小鼠卫星细胞增殖，暗示Wnt信号可能与mTOR信号协同调控PSCs行为。此外，mTOR以mTORC1和mTORC2两种复合物形式存在，对Rap敏感性不同，Rap不敏感性的mTORC2信号潜在贡献亦不能排除。
研究结论部分翻译如下：总之，本研究表明Ast与Nar联合有效促进了PSCs的增殖和分化，并改善了线粒体功能。从机制上讲，mTOR信号的激活参与了这些效应，因为mTOR的抑制减弱了Ast与Nar联合的有益作用。综合来看，这些发现Highlighted that Ast combined with Nar had the potential to serve as a functional, food-grade alternative for optimizing the culture system of PSCs, thereby providing a theoretical basis for future studies aimed at optimizing PSC expansion strategies for cultured meat production.（即：Ast与Nar联合有望作为优化PSCs培养体系的功能性、食品级替代品，从而为未来旨在优化细胞培养鱼肉生产用PSCs扩增策略的研究提供理论基础。）
