CCDC3缺失通过增强AGXT关联的肝细胞甘氨酸代谢减轻小鼠MAFLD及代谢衰老

《Genes & Diseases》：Loss of CCDC3 alleviates MAFLD and metabolic aging of mice through enhanced AGXT-associated hepatocyte glycine metabolism

　　

摘要：卷曲螺旋结构域蛋白3（Coiled-coil domain-containing protein 3，CCDC3）是一种由脂肪组织和内皮细胞分泌的蛋白，既往提示可能在衰老相关性肝脂肪变中发挥作用，但其在不健康饮食相关肝病中的作用及分子机制尚完全不清楚。研究人员利用Ccdc3敲除（Ccdc3–/–，C3KO）小鼠发现，Ccdc3缺失不仅在普通饲料（chow diet）喂养下改善小鼠的代谢衰老，还显著延迟西方饮食（western diet，WD）诱导的肥胖、胰岛素抵抗及惰性代谢，并减轻WD诱导的代谢功能障碍相关脂肪性肝病（Metabolic Dysfunction-Associated Fatty Liver Disease，MAFLD）进展及肝纤维化。小鼠肝脏样本RNA测序联合代谢组学分析显示，Ccdc3缺失上调肝细胞特异性丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶（alanine-glyoxylate aminotransferase，AGXT/AGT）——可催化甘氨酸合成的酶——的表达。一致地，Ccdc3缺失小鼠肝脏中甘氨酸水平与谷胱甘肽生成升高，胆汁酸周转与稳态增强，而炎症与脂肪生成被抑制。在人肝癌细胞及小鼠肝细胞经CCDC3条件培养基孵育模型中，补充甘氨酸亦观察到上述改善效应。因此，本研究揭示CCDC3通过调控肝细胞中AGXT关联的甘氨酸代谢调节MAFLD进展，鉴定CCDC3为MAFLD治疗的潜在靶点。

本文由Yiwei Zhang、Wenjuan Liao、Hongbing Liu、Shelya X. Zeng及Hua Lu（Tulane University School of Medicine）完成，论文发表于《Genes & Diseases》。

一、研究背景与立项依据

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（Metabolic Dysfunction-Associated Fatty Liver Disease，MAFLD；原名非酒精性脂肪性肝病 NAFLD）是最常见的慢性肝病，与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病及衰老密切相关，可进展为脂肪性肝炎、纤维化、肝硬化乃至肝癌，目前尚无获批的特效药物。MAFLD发病涉及"多重打击"，包括肝内脂质蓄积、线粒体功能障碍、内质网应激、氧化应激、胆汁酸代谢紊乱及脂肪组织–肝脏（Adipose Tissue–Liver，AT–Liver）轴调控异常等。脂肪组织作为内分泌器官可分泌多种脂肪因子（adipokines）调控肝脏代谢，其中CCDC3是由成熟脂肪细胞和血管内皮细胞主要分泌的蛋白，既往报道其表达与腹型肥胖相关，且Ccdc3缺失可改善老年小鼠脂肪肝（通过抑制脂肪组织脂生成），但CCDC3作为分泌蛋白在饮食诱导MAFLD中经AT–Liver轴的作用及下游机制完全未知。鉴于CCDC3功能存在细胞类型及微环境依赖性矛盾的文献报道，明确CCDC3在WD诱导MAFLD中对肝细胞的远程调控作用及分子机制具有重要理论与转化意义。

二、主要关键技术方法

研究人员采用基因打靶技术构建全身性Ccdc3^–/–（C3KO）及野生型Ccdc3^+/+（C3WT）小鼠（C57BL/6背景，≥6代回交），分两组分别予普通饲料或WD（40 kcal%脂肪，43 kcal%碳水化合物）喂养6个月建立MAFLD模型。体内进行葡萄糖耐量试验（Glucose Tolerance Test，GTT）、胰岛素耐量试验（Insulin Tolerance Test，ITT）、间接测热法（indirect calorimetry）评估代谢率，冷暴露诱导皮下白色脂肪组织（White Adipose Tissue，WAT）棕色化；取肝及脂肪组织行油红O染色、天狼猩红（Sirius Red）染色及F4/80免疫荧光染色评估脂滴沉积、纤维化及巨噬细胞浸润，测定肝甘油三酯（Triglyceride，TG）及血清胰岛素。体外构建稳定表达人CCDC3的HEK293条件培养基（C3-M）处理人肝癌细胞系Huh7、Hep3B及小鼠肝细胞AML12，部分实验补充甘氨酸（5 mM）。肝脏组织及细胞行定量逆转录PCR（qRT-PCR）、Western Blot检测基因及蛋白表达。对肝组织行RNA测序（RNA-sequencing）及代谢组学（气相色谱-飞行时间质谱 GC-TOF-MS 及液相色谱-四极杆-飞行时间质谱 LC-Q-TOF-MS）分析，筛选差异表达基因与代谢物并进行通路富集分析。统计学采用Student's t检验或单因素方差分析（One-way ANOVA），P≤0.05为差异显著。

三、研究结果

Aged Ccdc3-null mice display a younger metabolic pattern and improved survival

研究人员对普通饲料喂养的C3WT与C3KO小鼠进行生存及代谢分析。结果显示Ccdc3缺失不影响总体寿命，但延长75%存活期（雄鼠~21→~26月龄，雌鼠~20→~22月龄），提高24月龄内限制性平均生存时间。成年期（2–10月）体重增长、糖耐量与C3WT无差异；而16月龄老年C3KO小鼠耗氧量（Volume of Oxygen Consumption，VO₂）、二氧化碳产生量（Volume of Carbon Dioxide Production，VCO₂）、呼吸商（Respiratory Exchange Ratio，RER）、能量消耗（Energy Expenditure，EE）及摄食量均高于同龄C3WT，运动活性无差异。表明Ccdc3缺失使老龄小鼠维持较年轻的代谢模式，延缓代谢衰老。

Ccdc3 deletion alleviates WD-induced obesity, insulin resistance, and inert metabolism of mice

WD喂养6个月后，C3KO小鼠体重低10%–15%，GTT与ITT显著改善，空腹胰岛素降低；WD所致VO₂、VCO₂、RER及EE下降被Ccdc3缺失逆转，C3KO小鼠活动度更高且摄食量维持较高水平。表明Ccdc3缺失延缓WD诱导的肥胖、胰岛素抵抗及代谢惰性与衰老表型。

Loss of Ccdc3 significantly ameliorates WD-induced MAFLD and liver fibrosis

WD喂养下Ccdc3在WAT及肝脏（可能源于内皮细胞）上调，但Ccdc3缺失仅显著降低肥胖小鼠肝重，脂肪组织重量（皮下WAT归一化重、内脏WAT、棕色脂肪）无变化，WAT中脂生成、脂肪酸氧化及炎症基因及冷暴露诱导解偶联蛋白1（Uncoupling Protein 1，UCP1）表达与C3WT无差异，提示CCDC3主要靶器官为肝脏而非脂肪组织。C3KO肝脏TG水平较C3WT大幅降低，油红O染色示脂滴沉积减少，天狼猩红染色示纤维化减轻，F4/80⁺巨噬细胞浸润减少。脂生成基因（如Pparg、Scd1、Cidec）、炎症/NLRP3炎症小体基因（如Il1b、Tnf、Nlrp3）及纤维化基因（如Col1a1、Acta2、Tgfb1）在WD-C3WT肝脏上调而在C3KO中被抑制。表明CCDC3主要靶向肝脏促进WD诱导的脂肪变性、炎症与纤维化，Ccdc3缺失显著缓解MAFLD进展。

CCDC3 deletion up-regulates Agxt to induce glycine levels, consequently increasing glutathione and relieving inflammation

肝脏RNA-seq与代谢组学显示C3KO-WD肝脏代谢谱更接近普通饲料组。RNA-seq与qPCR及Western Blot证实WD-C3WT肝脏丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶（alanine-glyoxylate aminotransferase，AGXT/AGT）mRNA及蛋白下调，Ccdc3缺失使其恢复；代谢组学示肝甘氨酸水平WD-C3WT降低而C3KO恢复。C3KO肝脏谷胱甘肽升高，磷酸化NF-κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells）降低。体外CCDC3条件培养基抑制Huh7细胞AGXT表达，增强AML12细胞TNF-α诱导的NF-κB磷酸化；外源补充甘氨酸可拮抗CCDC3条件培养基对Hep3B中NF-κB磷酸化及AML12中脂生成基因的诱导。表明Ccdc3缺失通过上调肝细胞Agxt升高甘氨酸，增强抗氧化（谷胱甘肽）与抗炎能力缓解肝损伤。

CCDC3 deletion improves bile acid homeostasis by increasing glycine

RNA-seq示C3KO-WD肝脏胆汁酸合成[细胞色素P450 7A1（cytochrome P450 7A1，Cyp7a1）、Cyp7b1]、摄取[溶质载体有机阴离子转运家族成员1a1（solute carrier organic anion transporter family member 1a1，Slco1a1）]及解毒[Aldo-keto reductase family 1 member 7（Akr1b7）]基因上调，qPCR验证Cyp7a1、Slco1a1、Akr1b7升高。CCDC3条件培养基抑制Hep3B中CYP7A1蛋白，补充甘氨酸可恢复；AML12中C3-M抑制Cyp7a1/Cyp7b1 mRNA，甘氨酸补充可部分回补。表明Ccdc3缺失经Agxt–甘氨酸轴促进胆汁酸周转与稳态，辅助降低肝内胆固醇与TG。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出：脂肪组织分泌的CCDC3在WD下升高，经内分泌方式作用于肝细胞（受体尚未鉴定），Ccdc3缺失使老龄小鼠呈年轻代谢模式并提高中年期生存率，并减轻WD诱导的肥胖、胰岛素抵抗、MAFLD及纤维化。不同于普通饲料下CCDC3主要通过脂肪组织局部作用，长期WD下CCDC3主要靶向肝脏抑制AGXT表达——研究人员推测CCDC3–受体互作可能经PKC/ERK通路影响肝细胞核因子4α（Hepatocyte Nuclear Factor 4α，HNF-4α）等转录因子活性从而下调Agxt——致甘氨酸合成减少、谷胱甘肽不足、氧化应激与炎症增强、胆汁酸周转受抑及脂生成增加。外源甘氨酸可模拟Ccdc3缺失的保护效应。Ccdc3过表达与缺失在某些表型上的相似性可能与配体过量致受体脱敏有关，需进一步鉴定CCDC3受体。本研究阐明AT经分泌CCDC3远程调控肝细胞AGXT–甘氨酸代谢参与MAFLD进展，提出CCDC3–AGXT–Glycine–Bile Acid轴为MAFLD干预新靶点。

研究结论（翻译）： 综上所述，本遗传学研究揭示脂肪组织通过分泌CCDC3以内分泌方式直接靶向肝细胞，调控饮食诱导的肝脂肪变性、炎症及纤维化进程。具体而言，删除Ccdc3通过上调肝细胞特异性Agxt（催化甘氨酸生物合成）减轻MAFLD/代谢功能障碍相关脂肪性肝炎及饮食相关肥胖、胰岛素抵抗与代谢衰老。升高的甘氨酸通过增强抗氧化与抗炎能力及促进肝脏胆汁酸周转与稳态发挥保护作用。本研究不仅为脂肪组织在MAFLD进程中调控肝脏氨基酸代谢提供了新视角，也确定CCDC3为该过程的关键参与者及开发抗MAFLD疗法的潜力候选靶点。