核内FRS2通过USP7介导的稳定化及HNF4A失活驱动肝细胞癌进展

《Genes & Diseases》：Nuclear FRS2 drives hepatocellular carcinoma progression via USP7-mediated stabilization and HNF4A inactivation

　　

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）信号异常可驱动肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）及其他恶性肿瘤的发生。尽管成纤维细胞生长因子受体底物2（fibroblast growth factor receptor substrate 2，FRS2）是FGF通路的关键衔接蛋白，其在HCC中的失调及功能意义仍有待充分阐明。研究人员证实，FRS2在HCC中高表达，并呈现异位性核定位。在体外和体内模型中，核内FRS2（nuclear FRS2，nFRS2）均可促进HCC进展。机制上，缺氧通过募集importin 5触发FRS2核转位。HCC中泛素特异性蛋白酶7（ubiquitin-specific protease 7，USP7）的上调可减弱FRS2在Lys267位点的K48连接型泛素化，从而增强其蛋白稳定性。更关键的是，nFRS2与抑癌因子肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4A）相互作用，并通过募集三方基序蛋白21（tripartite motif-containing protein 21，TRIM21）促进其蛋白酶体降解。采用GNE-6776对USP7进行药理学抑制可抑制FRS2表达、阻断成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）信号，并恢复HNF4A的抑癌功能。值得注意的是，GNE-6776在仑伐替尼敏感和仑伐替尼耐药细胞及异种移植模型中均表现出强效治疗活性。总体而言，该研究确立了nFRS2在HCC进展中的一种非经典致癌作用，即通过USP7介导的稳定化和TRIM21依赖性的HNF4A失活发挥作用，并据此鉴定出USP7-FRS2轴为一个有前景的治疗靶点。

该研究发表于《Genes》，围绕肝细胞癌中FGF/FGFR信号通路关键衔接蛋白FRS2的非经典功能展开，系统阐明了FRS2在细胞核中的致癌作用及其分子调控网络。既往研究已表明，FGFR信号通路在胚胎发育、血管生成、代谢稳态和肿瘤发生中具有核心作用，在肝细胞癌中尤为活跃；临床上，仑伐替尼等靶向VEGFR/FGFR的多激酶抑制剂已用于HCC治疗，但整体生存获益并不稳定，提示仅从受体水平理解FGFR信号并不足以解释HCC的生物学异质性。另一方面，FRS2长期被视为位于胞质和胞膜近端的接头蛋白，负责将FGFR激活信号传递至RAS-ERK和PI3K-AKT级联通路，但其是否进入细胞核以及是否具有激酶非依赖性功能，过去并不清楚。与此同时，HNF4A作为维持肝细胞分化状态和抑制肝癌进展的主调控因子，在HCC中的持续降低已被反复观察到，但其蛋白失稳和功能受损的分子机制仍缺乏充分说明。基于这些问题，研究人员开展本研究，试图解析FRS2异常表达、核定位及其与HNF4A失活之间的联系，并进一步评估该分子轴的治疗价值。

研究人员首先在临床样本、公共数据库以及多种细胞和动物模型中确认，FRS2不仅在HCC中显著高表达，而且具有异常的核内富集现象。与正常肝组织和癌旁组织主要胞质定位不同，大部分HCC样本可检测到核内FRS2（nFRS2），且其高表达与晚期分期、AFP升高、总生存期和无病生存期缩短显著相关，提示nFRS2不仅是一个异常定位现象，更与肿瘤恶性进展密切相关。进一步的功能实验显示，人工构建的核定位FRS2显著增强HCC细胞增殖、克隆形成和体内成瘤能力，并在Sleeping Beauty转座子驱动的原发性肝癌模型中促进肿瘤负荷增加，证明nFRS2本身具有明确的促癌活性。

在方法上，研究主要结合了104例HCC配对临床样本及公开数据库分析、细胞免疫荧光（IF）、亚细胞分馏与免疫印迹（Western blot）、免疫共沉淀（Co-IP）、近邻连接分析（PLA）、免疫沉淀-质谱（IP-MS）、GST pull-down、体内泛素化检测、环己酰亚胺（CHX）半衰期实验、双荧光素酶报告、皮下与原位异种移植模型，以及Sleeping Beauty水动力尾静脉注射原发性肝癌模型等关键技术方法，从表达、定位、蛋白互作、泛素化修饰、转录活性和体内致瘤性多个层面进行验证。

以下为论文结果部分的分节解读。

FRS2 is overexpressed and accumulates in the nucleus of hepatocellular carcinoma cells
该部分通过IHC、TCGA、CPTAC及细胞模型证明FRS2在HCC中显著上调。更重要的是，研究人员发现FRS2在正常肝组织中主要位于胞质，而在72%的HCC肿瘤中出现核内积聚。通过患者队列分析可见，nFRS2阳性与不良临床病理特征密切相关，包括更高的pTNM分期和更高的血清AFP水平，并提示更差的总生存和无病生存。DEN/CCl⁴诱导的小鼠HCC模型及多种人源、鼠源HCC细胞系也重复了FRS2高表达和核定位现象。该结果说明，FRS2核积聚是HCC中的普遍异常事件，并具有预后意义。

nFRS2 promotes HCC progression
为验证核内FRS2的功能，研究人员构建了带有G2A突变和核定位信号（NLS）的nFRS2，使其脱离膜定位并优先进入细胞核。增殖实验、克隆形成实验以及FRS2敲低后的回补实验共同表明，nFRS2可显著促进HCC细胞生长。皮下和原位肝内异种移植模型进一步证明，nFRS2增强体内肿瘤形成。原发性小鼠肝癌模型中，无论在myr-AKT/NRAS^V12还是Yap S127A背景下，nFRS2均可增加肝重/体重比、肿瘤发生率、肿瘤数量和最大肿瘤体积，明确了其在肝癌进展中的驱动作用。

Hypoxia induces nuclear translocation of FRS2 by recruiting importin 5
研究人员接着探究FRS2为何会进入细胞核。结果显示，FGFR抑制剂仑伐替尼和LY2874455均不能减少FRS2核定位，FGF19刺激也不能诱导正常肝细胞FRS2入核，表明经典FGFR激活并非FRS2核转位的决定因素。相反，低氧（1% O₂）及CoCl₂化学缺氧均可显著诱导FRS2由胞质转入细胞核。进一步通过IP-MS筛选核内FRS2互作蛋白，发现核转运相关蛋白IPO5和KPNA1，其中Co-IP证实FRS2选择性结合IPO5而非KPNA1。低氧可增强FRS2与IPO5结合，敲低IPO5则可阻断低氧诱导的FRS2核转位。该部分说明，肿瘤微环境中的缺氧通过招募IPO5驱动FRS2异常入核。

USP7 stabilizes FRS2 by removing K48-linked ubiquitination at FRS2 K267
在确认nFRS2具有促癌功能后，研究进一步解释FRS2蛋白为何在HCC中积累。TCGA和qPCR结果提示FRS2 mRNA并未显著升高，说明异常主要发生在蛋白稳定性层面。通过Ubibrowser_v3预测并结合蛋白组数据库筛选，USP7被锁定为关键去泛素化酶。功能实验显示，USP7过表达可上调FRS2蛋白，而催化失活突变体USP7-C223S不能；USP7敲低则降低FRS2蛋白并缩短其半衰期。MG132可逆转USP7缺失导致的FRS2下降，提示蛋白酶体途径参与其中。进一步的泛素化实验表明，USP7主要去除FRS2的K48连接型泛素链，并作用于Lys267位点。K267R突变使FRS2对USP7调控失去敏感性，且能抵抗USP7敲低所致的增殖抑制。该结果建立了USP7-FRS2稳定性调控的直接分子基础。

nFRS2 promotes HCC progression by regulating HNF4A
为解析核内FRS2如何发挥致癌功能，研究人员聚焦其新发现的互作蛋白HNF4A。Co-IP、PLA与GST pull-down结果共同证明FRS2与HNF4A存在直接结合。结构预测和突变实验进一步显示，FRS2的PTB结构域与HNF4A多个关键残基相互作用，其中R85、R89、R134和I137对结合至关重要。功能上，nFRS2过表达降低内源性及外源性HNF4A蛋白，但不影响其mRNA；相反，敲低FRS2可提高HNF4A蛋白水平。CHX实验与MG132干预说明，nFRS2通过蛋白酶体依赖方式缩短HNF4A半衰期并增强其泛素化。双荧光素酶和qPCR结果表明，nFRS2抑制HNF4A转录活性，下调其激活靶基因PCK1、MAT1A，上调其抑制靶基因ECT2、MKI67。小鼠肿瘤组织中也观察到相同趋势。由此可见，nFRS2通过破坏HNF4A蛋白稳定性和转录功能促进HCC。

nFRS2 regulates HNF4A through TRIM21
在明确nFRS2可导致HNF4A降解后，研究继续寻找执行HNF4A泛素化的E3连接酶。通过筛查既往报道的候选分子，发现nFRS2特异性增强HNF4A与TRIM21而非PELI1或TRIM8的结合。FRS2敲低则削弱HNF4A-TRIM21相互作用，提示nFRS2发挥支架蛋白作用。TRIM21过表达增加HNF4A而非nFRS2的泛素化，TRIM21敲低则可阻断nFRS2诱导的HNF4A降解。更关键的是，破坏FRS2-HNF4A结合的HNF4A-4A突变不仅削弱其与TRIM21结合，还消除nFRS2对HNF4A稳定性、泛素化和转录活性的抑制，并使nFRS2无法逆转HNF4A介导的生长抑制。该部分清晰证明，nFRS2通过募集TRIM21促进HNF4A泛素化降解，是其核内致癌机制的核心环节。

The USP7-FRS2 axis is hyperactivated in HCC and functions as a potential therapeutic target
临床层面，USP7在HCC组织中显著高表达，并与FRS2蛋白水平正相关，与较差预后相关；新鲜组织检测还显示USP7、TRIM21、FRS2升高，而HNF4A降低。基于这一轴线，研究人员评估USP7抑制剂GNE-6776的治疗潜力。GNE-6776可抑制多种HCC细胞生长而对正常MIHA细胞影响较小，并呈时间依赖性下调FRS2、上调HNF4A及其靶蛋白PCK1、MAT1A。在仑伐替尼敏感的Hep3B和仑伐替尼耐药的SNU-449模型中，GNE-6776均能抑制增殖和克隆形成；与仑伐替尼联用时，抗肿瘤效应进一步增强。体内原位和皮下异种移植实验显示，GNE-6776单药即可延长生存、减少肿瘤体积和Ki-67指数，并降低肿瘤中FRS2表达；联合仑伐替尼治疗效果最强，尤其在耐药模型中依然显著。该结果提示，USP7-FRS2轴既是HCC的重要驱动因素，也是具有转化潜力的治疗靶点。

讨论部分总结
论文讨论指出，本研究扩展了对FGFR信号的传统认识。FRS2不再仅是膜近端衔接蛋白，而是可在缺氧肿瘤微环境驱动下进入细胞核、参与转录调控异常的致癌因子。与已有核内FGFR研究相比，FRS2缺乏经典NLS，其经由IPO5介导入核，提示存在不同于受体本身的核转运机制。研究同时揭示，HNF4A在HCC中的失活不仅来自转录抑制，也来自nFRS2搭桥促进TRIM21介导的蛋白降解，从而导致肝细胞分化程序受损和增殖程序增强。对于FRS2蛋白稳态，本研究首次鉴定USP7为其关键去泛素化酶，并将作用位点精确定位于K267。治疗层面，该研究提示，相比单纯抑制FGFR激酶活性，靶向USP7可同时削弱经典FGFR-FRS2信号和FRS2核内非经典致癌功能，从而在敏感和耐药背景下均产生抑癌效应。

研究结论翻译：
总之，该研究揭示了FRS2一种非经典的核内致癌功能，并确定USP7介导的FRS2稳定化是HCC中的一个关键脆弱性。以GNE-6776靶向USP7可抑制FRS2表达、恢复HNF4A的抑癌活性，并克服对仑伐替尼等FGFR通路抑制剂的耐药。这些发现为将USP7抑制剂作为单药或与现有药物联用应用于HCC治疗提供了有力依据。