RYR3的有害功能获得性变异导致发育性癫痫性脑病

《Genes & Diseases》：Deleterious gain-of-function variants in RYR3 underlie developmental and epileptic encephalopathy

　　

Ryanodine受体3（RYR3）是一种高度表达于人脑中的钙（Ca²⁺）释放通道，但其在神经系统疾病中的作用尚不明确。通过对420名不相关的发育性癫痫性脑病（DEE）患者进行全外显子测序，研究人员鉴定出5名携带RYR3复合杂合变异的个体，均表现为早发性癫痫性痉挛、高度失律及严重发育迟缓。结构定位显示，致病性变异聚集在关键结构域，包括SPRY、桥接螺线管结构域（Bsol）和中央螺线管结构域（Csol）。为探究功能后果，研究人员建立了患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）并分化为皮质神经元。RYR3^{H2626R/A3636G}变异未损害神经祖细胞迁移，但导致显著的神经元发育异常，如成熟延迟、轴突缩短和分支减少。功能检测表明，内质网中RYR3介导的Ca²⁺释放过度增加，导致神经元过度兴奋，而使用ryanodine受体稳定剂S107治疗后，该现象显著缓解。转录组谱分析揭示了RYR3表达升高，且差异表达基因在Ca²⁺信号传导、神经元分化和突触通路中富集。蛋白质组学分析进一步证实了神经元发育、突触功能和线粒体代谢的紊乱。总体而言，研究人员的发现提供了首个功能性证据，表明RYR3的功能获得性变异破坏Ca²⁺稳态、损害神经元发育并驱动DEE发病机制。该工作拓展了RYR3相关疾病的临床和遗传谱，并将RYR3确立为DEE的新型致病基因及潜在治疗靶点。

### 论文解读：RYR3功能获得性变异在发育性癫痫性脑病中的致病机制

#### 研究背景与现存问题
发育性癫痫性脑病（DEE）是一组严重的早发性神经发育障碍，以难治性癫痫、重度发育迟缓及脑电图异常（如高度失律）为特征。既往研究已将ryanodine受体（RYRs）家族中的RYR1和RYR2基因变异明确关联至多种疾病（如中央轴空病、恶性高热和心律失常），而RYR3虽然在人类脑组织（尤其是海马和基底节）中高表达，但其在神经系统疾病中的作用长期未获阐明。截至本研究，仅有三项临床研究报告了5例携带RYR3变异且表现为DEE的患者，其中4例呈现婴儿癫痫性痉挛综合征（IESS）表型，但这些研究均缺乏功能性实验验证，现有证据不足以建立RYR3变异与中枢神经系统异常之间的直接因果关系。因此，研究人员旨在通过患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）神经元疾病模型，系统验证RYR3变异与DEE表型的关联，并揭示其致病机制，为精准治疗提供潜在靶点。该论文发表于《Genes》。

#### 主要关键技术方法
研究人员采用全外显子测序（WES）对420例IESS患者进行三人家系分析，鉴定出5名携带RYR3复合杂合变异的先证者。利用AlphaFold3预测RYR3蛋白三级结构，并通过PyMOL进行三维可视化与结构域定位。选取先证者2（RYR3^{H2626R/A3636G}）的外周血样，使用CytoTune?-iPS 2.0仙台病毒重编程试剂盒生成iPSCs，并分化得到神经祖细胞（NPCs）及成熟神经元细胞（NCs）。通过Fluo-4 AM钙荧光探针标记和流式细胞术检测胞质Ca²⁺浓度，采用Maestro Edge多电极阵列（MEA）系统记录神经元电活动。提取NPCs和NCs总RNA进行RNA测序，使用DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs），并通过clusterProfiler进行Gene Ontology（GO）和KEGG通路富集分析；同时提取NCs全细胞蛋白进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学分析。

#### 研究结果
##### 临床表型
5名先证者（3男2女）均携带RYR3复合杂合变异（包括6个错义变异、2个剪接变异、1个缺失和1个重复），变异遗传自未受影响的父母。所有患者均出现癫痫性痉挛（ES）、脑电图高度失律及发育迟缓，诊断为IESS。仅先证者2通过促肾上腺皮质激素（ACTH）治疗在1岁10个月时实现癫痫控制，其余4例为药物难治性癫痫。所有患者均表现为重度全面发育迟缓，包括语言缺失、大运动障碍、肌张力障碍和孤独症样行为。

##### 蛋白结构建模
将鉴定出的变异映射至RYR3预测的三级结构，发现致病性变异集中在关键结构域：SPRY结构域（p.Gly649Arg等）、桥接螺线管结构域（Bsol）（p.Asn2042Thr等）和中央螺线管结构域（Csol）（p.Glu3596del等）。基于同源RYR1/RYR2中Csol结构域是突变“热点”且常关联功能获得性（GOF）机制，研究人员推测RYR3的GOF变异可能通过破坏通道关闭状态导致Ca²⁺渗漏。

##### 体外分化揭示神经发育损伤
患者来源的RYR3^{H2626R/A3636G} NCs在分化第21天表现出神经元数量显著减少、轴突长度缩短、分支复杂性下降（电缆长度、一级分支长度、复杂性指数、总节点数、凸包边界尺寸及Sholl分析总和均显著低于对照组RYR3^A3636G/+和RYR3^+/+）。分化第4至8天已出现明显的分化缺陷，包括形态幼稚、细胞稀少、轴突短小。但神经祖细胞迁移能力在划痕实验中未见显著差异。

##### RYR3^{H2626R/A3636G} 诱导神经发育与突触信号相关基因失调
RNA测序结果显示，RYR3^{H2626R/A3636G} NCs中RYR3表达显著高于对照组（p < 0.01 vs. RYR3^A3636G/+，p = 0.02 vs. RYR3^+/+），提示GOF效应。DEGs在GO功能注释中富集于“神经元分化”“钙离子结合”和“突触传递”；KEGG通路富集于“神经活性配体-受体相互作用”“钙信号通路”“PI3K-Akt信号通路”等。蛋白质组学分析进一步揭示差异表达蛋白在“轴突导向”“突触组织”“神经系统发育”“钙依赖性磷脂结合”及“线粒体代谢”中富集，与转录组结果高度一致。

##### S107改善RYR3^{H2626R/A3636G} 神经元中钙稳态失调
Fluo-4 AM钙成像显示，RYR3^{H2626R/A3636G} NCs中荧光细胞数量和荧光强度均显著高于对照组（p < 0.01）。流式细胞术证实其高荧光细胞比例（81.94%）远高于对照组（50.35%和69.22%）。经ryanodine受体稳定剂S107处理后，RYR3^{H2626R/A3636G} NCs胞内Ca²⁺荧光强度下降，而对照组无显著变化。咖啡因处理则使各组成Ca²⁺水平均升高，其中RYR3^{H2626R/A3636G}组增幅最大（94.35%），进一步支持GOF机制。

##### RYR3^{H2626R/A3636G} 增强神经元兴奋性且S107可缓解
MEA记录显示，RYR3^{H2626R/A3636G} NCs的平均放电率显著高于对照组及S107处理组；S107处理后爆发活动显著降低。结合S107对Ca²⁺泄漏的抑制，这些结果证实S107可有效降低由RYR3 GOF变异引起的神经元过度兴奋。

#### 讨论与结论
本研究从5例DEE患者的RYR3复合杂合变异出发，通过患者iPSC疾病模型首次提供了GOF变异导致DEE的直接功能性证据。研究证实，RYR3^{H2626R/A3636G} 变异通过破坏关键结构域（特别是Csol结构域）的稳定性，导致RYR3通道“结构域解链”，引发内质网Ca²⁺过度释放，胞质Ca²⁺超载进而损害神经元发育、突触可塑性和线粒体能量代谢，最终驱动DEE/IESS表型。这一结论与既往RYR3敲除（KO）动物模型中仅见微弱表型（如社交减少）而GOF变异导致严重疾病的现象形成“功能不对称性”，提示发育期大脑对RYR3介导的Ca²⁺信号增加高度敏感。S107作为一种可穿越血脑屏障的RYR通道稳定剂，在患者神经元中显著降低胞内Ca²⁺和神经元兴奋性，表明其具有治疗潜力。

**研究结论**：RYR3功能获得性变异通过破坏Ca²⁺稳态、损害神经元发育和突触功能，并干扰线粒体代谢，从而驱动发育性癫痫性脑病的发病机制。该研究扩展了RYR3相关疾病的临床和遗传谱，将RYR3确立为DEE的新型致病基因及潜在治疗靶点。