《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：A human intestinal epithelial-mesenchyme-immune triple culture system for disease modelling
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肠道黏膜在营养吸收、药物代谢及病原体防御中发挥关键作用。单细胞技术的进步揭示了执行这些多样化功能的各类细胞所承担的特殊角色。除肠上皮细胞（IECs）外，成纤维细胞调控细胞外基质（ECM）并调节促炎信号传导，而抗原呈递细胞（APC），包括巨噬细胞（MΦs）和树突
肠道黏膜在营养吸收、药物代谢及病原体防御中发挥关键作用。单细胞技术的进步揭示了执行这些多样化功能的各类细胞所承担的特殊角色。除肠上皮细胞（IECs）外，成纤维细胞调控细胞外基质（ECM）并调节促炎信号传导，而抗原呈递细胞（APC），包括巨噬细胞（MΦs）和树突状细胞（DCs），则维持肠道稳态与免疫应答。然而，现有体外人肠道模型仍缺乏对此类细胞复杂性的整合。
为构建该模型，研究人员将肠上皮细胞、肠成纤维细胞及抗原呈递细胞进行共培养，并采用了成体与胎儿来源细胞以支持肠道发育、屏障功能、炎症及病毒感染的相关研究。
研究人员成功建立了一种先进的多细胞肠道共培养模型，该模型重现了天然黏膜环境的关键特征，包括ECM沉积、潘氏细胞（Paneth cell）分化及功能性免疫相互作用。该模型有效模拟了病毒感染期间的免疫应答，体现了整合多种细胞类型及不同发育阶段的实用价值。
本共培养模型通过纳入既往体系所缺乏的多细胞复杂性，提升了体外研究的生理相关性。该进展使得研究人员能够探索肠道健康与疾病中的上皮-间充质-免疫对话，为研究肠道发育、屏障功能障碍及感染相关病理提供了有力平台。
该研究发表于《Frontiers in Cell and Developmental Biology》。
肠道是人体最大的外环境接触组织，其黏膜衬里在营养吸收、药物首过代谢以及抵御病原体入侵方面发挥着至关重要的作用。肠上皮细胞（IECs）是构成肠道屏障的主体，但肠道的发育与维持还依赖于IECs与其他胚层来源细胞之间的精密相互作用。肠成纤维细胞（IFs）不仅形成并管理着肠道黏膜的动态细胞外基质（ECM），为IECs提供结构支持，还能分泌免疫调节性细胞因子，在发育过程中维持免疫细胞耐受性，并在损伤和感染期间建立炎症反应。此外，肠道作为最大的免疫器官，容纳了体内75%的免疫细胞，其中抗原呈递细胞（APCs）如巨噬细胞（MΦs）和树突状细胞（DCs）在维持肠道稳态和响应环境挑战方面具有核心作用。然而，现有的体外模型，包括作为金标准的人源肠道类器官和三维（3D）模型，主要包含IECs，未能充分捕捉肠道黏膜的细胞复杂性，且存在寿命短、空间取向受限等局限。器官芯片（OoC）系统虽能部分重现肠道黏膜特征，但高成本、缺乏标准化及操作复杂等因素制约了其广泛应用。为克服上述局限，研究人员开发了一种基于标准细胞培养插座的模块化人肠道共培养模型，逐步模拟包含IECs、IFs和APCs的黏膜细胞环境，并利用成年与胎儿来源细胞以研究不同发育阶段。
在技术方法方面，研究人员采用人胎儿肠道组织（ gestational age 16–18周）通过机械与酶解方法分离隐窝以建立胎儿小肠类器官及原代肠成纤维细胞培养；同时采用商业化来源的成人小肠与结肠成纤维细胞。将IECs与IFs以直接接触方式顺序接种于标准细胞培养插座上，使用改良的肠道黏膜培养基（IMM）进行维持。第14天时，将外周血单个核细胞来源的单核细胞分化获得的树突状细胞（DCs）或巨噬细胞（MΦs）接种于插座的基底侧，建立IEC-IF-DC/APC三重培养系统。研究还纳入了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，对28,528个细胞及37,493个基因进行转录组解析，采用CellChat进行细胞间通讯分析，并利用CLindex? Sample Multiplexing Kit进行样本多重标记后通过GEXSCOPE? Single Cell RNA Library Kit在Illumina NovaSeq X平台进行测序。在功能验证方面，采用跨上皮电阻（TEER）测量、异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran）通透性实验评估屏障功能；通过免疫荧光、流式细胞术及ELISA进行表型与功能分析；并采用肠道黏膜炎症模型（ImmunoCult? DC Maturation Supplement或LPS/IFN-γ、IL-4刺激）以及人巨细胞病毒（CMV）和人类肠道病毒A71（EV-A71）感染模型进行疾病模拟。
上皮-间充质对话调控ECM组织与肠道屏障稳态。研究人员首先建立了包含成人（a-IECs/a-IFs）和胎儿（f-IECs/f-IFs）来源IECs与IFs的共培养模型。通过免疫荧光检测发现，I型和III型胶原仅在包含IFs的条件下沉积，且仅共培养组形成了胶原纤维网络；基因表达分析证实IFs显著贡献ECM相关基因（COL1A1、COL3A1、COL4A1、FN1、TNC）的表达（p < 0.001），且IEC-IF直接接触对ECM网络形成至关重要。在潘氏细胞分化方面，IEC-IF共培养中溶菌酶（LYZ）阳性细胞数（89.4 ± 19.1和51.1 ± 10.4 cells/mm
2）显著高于IEC单培养（3.8 ± 3.3和2.1 ± 2.8 cells/mm
2）（p < 0.001），该效应受Wnt/R-spondin/BMP信号通路支持；但结肠来源IEC-IF共培养未出现此现象，体现了肠段特异性。长期TEER监测显示，IEC-IF共培养可将屏障稳定性维持至第44天，优于IEC单培养（第30天后开始衰退）。
肠成纤维细胞-上皮相互作用调控细胞因子表达并调节DC表型。RT-qPCR分析显示IECs表达更高水平的TNF，而IFs显著高表达IL1β和IL6（p < 0.001）；ELISA检测证实a-IF单培养分泌高水平IL-6（75.2 ± 12.2 ng/ml），而IEC-IF共培养显著降低（2.12 ± 1.5 ng/ml）（p < 0.001），提示二者对话调控细胞因子微环境。将DCs整合入IEC-IF模型后，流式细胞术显示三重培养中DCs的CD14表达显著增加（p < 0.001），CD86显著降低（p < 0.004），CD80在共培养条件下降低（p < 0.001），而肠道驻留DC标志物CD103显著增加（p < 0.001），表明DCs获得了肠道耐受性表型。
单细胞RNA测序鉴定上皮分化状态、成纤维细胞亚群及供体特异性差异。UMAP分析鉴定出7个主要细胞簇，包括肠成纤维细胞、增殖性上皮祖细胞、未成熟上皮群体及分化上皮亚群。胎儿培养中富含ZG16+杯状细胞，成人培养则含有更多REG4+分泌细胞及CCK+肠内分泌细胞（EECs）；还发现一表达OLFM4
high及应激炎症相关转录本的 transit-amplifying/干细胞样群体，以及一活化上皮细胞簇表达LTB、TNF等炎症基因。供体差异方面，成人培养含更高比例的分化/成熟上皮（57.6% vs. 39.8%），胎儿样本中成纤维细胞和分泌群体比例更高。CellChat分析显示肠成纤维细胞具有最强的 outgoing 通讯信号，以ECM蛋白沉积为主。值得注意的是，胎儿循环细胞簇表达间充质/成纤维样标记，即使无外源IF添加的f-IEC培养中亦然，提示胎儿干细胞可能存在上皮-间充质转化。
DC和MΦ免疫激活及表型转换响应促炎刺激。稳态下DCs在共培养中未被激活；而促炎刺激（ImmunoCult? DC Maturation Supplement）48小时后，DCs形成紧密聚集簇，流式显示CD80、CD83、CD86、CD108显著升高（p < 0.0001），CD103显著降低（p < 0.0001），IL-12p40分泌显著增加（1337.6 ± 797.5 pg vs. 4.5 ± 0.5 pg）（p < 0.0001），证实获得活化表型。MΦs的整合亦成功实现：M0/M1/M2各亚型均保持高存活率（>93%），且M1刺激上调CD80/CD86，M2刺激上调CD206/CD209，有效重现了MΦ可塑性。
基质和免疫细胞参与病毒感染动态。CMV感染实验显示，病毒仅在含f-IFs的条件下复制，IE1抗原与EPCAM阴性细胞共定位，证实IFs为肠道CMV感染的主要靶细胞。EV-A71感染实验中，f-IECs+f-IFs+DCs组病毒拷贝数及感染性颗粒数显著高于f-IECs单培养；且仅顶侧检测到病毒脱落。DCs的存在导致细胞内ATP显著增加（p < 0.05），提示代谢活性增强与免疫激活相关；而E11感染未显示同等效应，排除了单纯细胞数量增加的干扰。
研究讨论部分指出，该模型平衡了类器官的简便性与OoC系统的复杂性，在广泛使用的细胞培养插座上实现了易于操作的模块化组装。模型能有效重现上皮-间充质-免疫对话，ECM沉积需要IEC-IF直接接触，潘氏细胞分化具有肠段特异性，与Hickey等人关于肠道功能"邻域"的研究以及Maimets等人关于间充质调控Wnt信号决定区域特性的体内研究相吻合。IL-6的精细调控使其成为炎症性肠病（IBD）机制研究与治疗筛选的潜在靶点。DCs在共培养中获得肠道驻留耐受性表型，而scRNA-seq的技术限制（如LGR5低丰度、LYZ/MUC2转录本在解离过程中易丢失）解释了部分经典标志物未检出的现象。病毒感染方面，CMV靶向IFs的特征与体内一致，EV-A71模型则支持"特洛伊木马"式DC介导的病毒传播假说。模型局限性在于尚未纳入M细胞、簇细胞、B/T细胞、微生物组等组分，且非等基因系统可能影响细胞间相互作用；未来可整合诱导多能干细胞（iPSCs）实现全等基因培养。
研究结论：该共培养模型通过纳入既往体系缺乏的多细胞复杂性，提升了体外研究的生理相关性，使得探索肠道健康与疾病中的上皮-间充质-免疫对话成为可能，为研究肠道发育、屏障功能障碍和感染相关病理提供了有力平台。该先进肠道黏膜模型已能增强现有培养模型的生理相关性，且未来结合微流控系统具有进一步推进人肠道健康与疾病研究的潜力。
