《Molecular Horticulture》：A miR858 variant negatively regulates resistance to tea leaf spot through targeting the CsMYB1–CsPME41 module
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近年来，由真菌Epicoccum sorghinum引起的茶树叶斑病（tea leaf spot）严重影响了中国茶叶的产量与品质。瞬时过表达和反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, AsODN）检测表明，上调定位于细胞核的转录因子C
近年来，由真菌Epicoccum sorghinum引起的茶树叶斑病（tea leaf spot）严重影响了中国茶叶的产量与品质。瞬时过表达和反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, AsODN）检测表明，上调定位于细胞核的转录因子CsMYB1增强了茶树叶片对E. sorghinum侵染的抗性。在转基因本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中过表达CsMYB1赋予了对灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的抗性。对茶树叶片中瞬时过表达CsMYB1的多组学（multi-omics）分析表明，CsMYB1诱导了众多抗病基因的表达。DNA亲和纯化测序（DNA affinity purification sequencing, DAP-seq）检测表明，CsMYB1可激活抗病基因果胶酯酶/果胶酯酶抑制剂41（pectinesterase/pectinesterase inhibitor 41, CsPME41）的表达。β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase）和双荧光素酶（dual-luciferase）检测显示，csi-miR858-3p_L-1靶向并切割CsMYB1。此外，茶树叶片中的瞬时过表达和AsODN检测以及转基因csi-miR858-3p_L-1本氏烟草植株表明，提高csi-miR858-3p_L-1水平增加了茶树叶片对E. sorghinum的感病性。CsMYB1、CsPME41和csi-miR858-3p_L-1在茶树叶片中的相对表达水平在响应E. sorghinum侵染时呈现出明显的时空模式。本研究表明，csi-miR858-3p_L-1–CsMYB1–CsPME41模块在茶树对E. sorghinum感染的抗病响应中发挥作用，为抗病育种提供了关键数据。
**论文解读文章**
**研究背景与科学问题**
茶树叶斑病（tea leaf spot）是由真菌Epicoccum sorghinum引起的一种新兴叶部病害，近年来在中国严重降低了茶叶的产量与品质。然而，目前对该病害的研究十分有限，尚未建立有效的防控措施。因此，解析茶树应答E. sorghinum侵染的分子机制，挖掘关键抗病基因，对于抗病品种选育和病害防控具有重要意义。MYB转录因子（transcription factor, TF）家族在植物生长发育及胁迫响应中发挥重要作用，其中MYB1成员已被报道参与次生代谢物合成、非生物胁迫等过程。在茶树中，CsMYB1已知参与调控毛状体形成和没食子酸基儿茶素合成，但其在抗病响应中的分子功能尚不清楚。MicroRNA（miRNA）是一类长约20–24 nt的非编码小RNA，通过序列特异性靶向mRNA介导其切割或翻译抑制。miR858在多种植物中参与生长发育和胁迫响应，但在茶树中的角色未见报道。前期通过对E. sorghinum接种茶树叶片的miRNA和mRNA测序，研究人员发现感染诱导的csi-miR858-3p_L-1与CsMYB1可能构成病原-宿主互作的关键模块。基于此，研究人员提出假设：csi-miR858-3p_L-1–CsMYB1对在茶树叶斑病抗性中发挥重要调控作用。
**研究内容、结论与意义**
研究人员通过瞬时过表达、反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, AsODN）沉默、转基因本氏烟草（Nicotiana benthamiana）验证、多组学（multi-omics）分析、DNA亲和纯化测序（DNA affinity purification sequencing, DAP-seq）、电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）、酵母单杂交（yeast one-hybrid, Y1H）、双荧光素酶（dual-luciferase, Dual-LUC）报告基因检测、GUS组织化学染色及降解组测序（degradome sequencing）等方法，系统解析了csi-miR858-3p_L-1–CsMYB1–CsPME41模块在茶树抗E. sorghinum侵染中的调控作用。研究发现：CsMYB1作为转录因子正调控茶树抗病性；CsMYB1通过激活靶基因CsPME41（果胶酯酶/果胶酯酶抑制剂41）的表达增强抗性；csi-miR858-3p_L-1靶向切割CsMYB1 mRNA，负调控茶树抗病性；该模块各组分在侵染后呈现动态的时空表达模式。本研究首次揭示了csi-miR858-3p_L-1–CsMYB1–CsPME41模块在茶树抗病响应中的角色，为茶树抗E. sorghinum育种提供了关键靶点与理论依据。该论文发表在《Molecular Horticulture》。
**主要技术方法概述（不超过250字）**
研究人员以三年生茶树品种‘福鼎大白茶’（Camellia sinensis cv. Fuding-dabaicha）为材料，病原菌为E. sorghinum菌株CGMCC3.20150和灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）菌株CGMCC3.20932。关键方法包括：1）瞬时过表达和AsODN沉默技术评估基因功能；2）农杆菌介导的稳定遗传转化建立CsMYB1和csi-miR858-3p_L-1过表达本氏烟草株系；3）转录组与代谢组联合分析鉴定差异表达基因与差异代谢物；4）DAP-seq鉴定CsMYB1全基因组靶标；5）EMSA验证CsMYB1与CsPME41启动子的体外结合；6）Y1H和Dual-LUC检测体内结合与转录激活；7）降解组测序和GUS染色验证miRNA靶向切割；8）qPCR检测真菌生物量。所有数据采用Student's t检验或单因素方差分析（Tukey检验）进行统计。
**研究结果**
**CsMYB1 functions as a TF（CsMYB1作为转录因子发挥功能）**
通过系统发育分析发现CsMYB1与拟南芥AtMYB8、AtMYB6高度同源；亚细胞定位显示CsMYB1-GFP荧光信号位于细胞核；转录激活实验表明CsMYB1在酵母中具有转录激活活性。
**CsMYB1 positively regulates disease resistance in tea plants（CsMYB1正调控茶树抗病性）**
在转基因本氏烟草中过表达CsMYB1显著减小了灰葡萄孢菌侵染后的病斑面积；在茶树叶片中瞬时过表达CsMYB1降低了E. sorghinum病斑大小和真菌DNA含量；AsODN沉默CsMYB1则导致病斑增大、真菌DNA含量升高，证明CsMYB1正调控抗病性。
**Transcriptomic and metabolomic analysis to identify genes and metabolites affected by CsMYB1（转录组与代谢组分析鉴定受CsMYB1影响的基因与代谢物）**
转录组分析发现CsMYB1过表达诱导5,560个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），显著富集于植物-病原互作、植物激素信号转导等通路；代谢组鉴定110个差异丰度代谢物（differentially abundant metabolites, DAMs），富集于甘油磷脂代谢、ABC转运等通路；基因-代谢物互作网络筛选出10个核心调控基因（如CsLAC7、CsWRKY等），RT-qPCR验证与转录组趋势一致。
**DNA affinity purification sequencing (DAP-seq) on CsMYB1（CsMYB1的DAP-seq分析）**
DAP-seq共鉴定1,136个共有结合峰，主要分布于基因间区及启动子区；结合位点偏好转录起始位点（TSS）附近1,000 bp内；GO和KEGG富集分析显示靶基因参与NADPH脱氢酶活性、光合作用等过程；进一步筛选出CsPME41作为候选靶基因，并预测其启动子结合基序。
**CsMYB1 activates the expression of CsPME41 gene（CsMYB1激活CsPME41基因表达）**
EMSA证实CsMYB1直接结合CsPME41启动子；Y1H和Dual-LUC实验表明CsMYB1与CsPME41启动子结合并激活荧光素酶活性；RT-qPCR显示CsMYB1过表达使CsPME41表达上调3.4倍，沉默后下调41.7%。
**CsPME41 positively regulates disease resistance in tea plants（CsPME41正调控茶树抗病性）**
瞬时过表达CsPME41的茶树叶片在E. sorghinum接种后病斑显著减小；AsODN沉默CsPME41导致病斑显著增大，表明CsPME41正调控抗病性。
**csi-miR858-3p_L-1 can cleave CsMYB1 mRNA（csi-miR858-3p_L-1能够切割CsMYB1 mRNA）**
降解组测序显示csi-miR858-3p_L-1在CsMYB1 mRNA第299位核苷酸处切割；GUS染色实验显示共注射csi-MIR858-3p_L-1与CsMYB1-GUS的叶片染色变浅；Dual-LUC检测证实csi-miR858-3p_L-1显著降低CsMYB1报告基因的荧光比值；RT-qPCR显示AsODN沉默csi-miR858-3p_L-1后CsMYB1表达上调1.6倍、CsPME41上调0.3倍。
**csi-miR858-3p_L-1 negatively regulates plant disease resistance（csi-miR858-3p_L-1负调控植物抗病性）**
转基因本氏烟草过表达csi-miR858-3p_L-1后对灰葡萄孢菌的病斑显著增大；茶树瞬时过表达csi-miR858-3p_L-1后E. sorghinum病斑增大；AsODN沉默csi-miR858-3p_L-1后病斑显著减小，表明该miRNA负调控抗病性。
**Expression changes of CsMYB1 mRNA, CsPME41 mRNA, and csi-miR858-3p_L-1 in tea leaves in response to infection by E. sorghinum hyphae（茶树叶片中CsMYB1 mRNA、CsPME41 mRNA和csi-miR858-3p_L-1响应E. sorghinum侵染的表达变化）**
在离体茶枝的第一、二、三叶中，接种E. sorghinum后不同时间点（12、24、36、48 hpi）检测三者表达。CsMYB1在12和36 hpi下调，24和48 hpi上调；CsPME41在24、36、48 hpi显著上调；csi-miR858-3p_L-1在36 hpi上调，24和48 hpi下调，呈现相关的变化模式。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，本研究首次报道CsMYB1在茶树中的抗病功能，前人研究多集中于生长发育与非生物胁迫；首次发现CsMYB1通过激活CsPME41正调控抗病性，且CsPME41是茶树中新鉴定的抗病基因；首次发现csi-miR858-3p_L-1通过靶向CsMYB1负调控茶树抗病性，与拟南芥中miR858增加病原敏感性的结果一致。局限性包括：CsPME41的具体作用机制尚需深入；由于茶树遗传转化困难，未能在茶树中进行稳定转化验证。未来需分析更复杂的调控网络，并探索转录因子与靶基因启动子的互作细节。研究结论可翻译为：本研究揭示了csi-miR858-3p_L-1–CsMYB1–CsPME41模块在茶树对Epicoccum sorghinum感染的抗病响应中发挥作用，为抗病育种提供了关键数据。
