PtGH1和PtCBM1在小麦叶锈病菌致病过程中促进宿主定殖的关键作用

《Phytopathology Research》：The pivotal role of PtGH1 and PtCBM1 in facilitating host colonization during wheat leaf rust pathogenesis

　　

小麦叶锈病由专性活体营养型真菌小麦叶锈菌（Puccinia triticina, Pt）引起，对全球小麦生产构成重大威胁。真菌病原体常利用植物细胞壁降解酶突破宿主屏障，其中糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases, GHs）提供水解活性，碳水化合物结合模块（Carbohydrate-Binding Modules, CBMs）实现底物识别。然而，其在叶锈真菌中的具体作用研究尚有限。研究人员对两个Pt基因PtGH1和PtCBM1进行了功能鉴定。PtCBM1作为一种碳水化合物结合模块蛋白，虽缺乏水解酶活性，但能够结合纤维素并增强纤维素酶活性；而PtGH1编码的β-葡聚糖酶通过非经典分泌途径分泌。两种蛋白均能在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中抑制Bax诱导的细胞死亡，提示其具有免疫抑制活性。通过宿主诱导基因沉默（Host-Induced Gene Silencing, HIGS）技术在小麦中沉默任一基因均可显著降低真菌毒力、削弱菌丝生长并增强宿主防御。这些发现共同将蔺草识别为通过互补机制发挥作用的独特毒力因子，涉及宿主细胞壁的物理辅助和酶促降解。这种双重策略揭示了叶锈真菌如何克服宿主免疫，并为开发持久性小麦抗性提供了潜在分子靶标。

小麦叶锈病是由专性活体营养型真菌小麦叶锈菌（Puccinia triticina, Pt）引起的全球性重大病害，对粮食安全构成持续威胁。在病原菌与宿主的博弈中，植物细胞壁作为第一道物理防线，其 breach（突破）与否直接影响侵染成败。真菌病原体进化出精密的毒力策略，其中植物细胞壁降解酶（Plant Cell Wall-Degrading Enzymes, PCWDEs）的 secreted（分泌）是关键环节。这些酶属于碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active Enzyme, CAZyme）超家族，通过降解结构性多糖实现组织穿透和营养获取。CAZymes 按功能分为糖苷水解酶（GHs）、多糖裂解酶（Polysaccharide Lyases, PLs）、碳水化合物酯酶（Carbohydrate Esterases, CEs）、糖基转移酶（Glycosyltransferases, GTs）、辅助活性酶（Auxiliary Activities, AAs）及碳水化合物结合模块（CBMs）等多个家族。近年研究表明，CAZymes 的作用已超越传统的降解功能，还涉及对宿主免疫的调控，但其在专性活体营养型锈菌中的机制仍不清楚。

基因组分析显示，Pt 的 CAZyme 家族整体呈收缩趋势，但特定基因在侵染早期呈选择性上调表达，提示其存在精确的时空调控。然而，由于缺乏高效的诱变和转化体系，Pt 的毒力机制研究长期受阻，其 CAZyme 基因的功能信息尤为匮乏。此前研究虽鉴定了若干 Pt 效应子，但 CAZyme 的系统功能研究仍是空白。基于此，研究人员选取了在侵染相关时间点显著诱导表达的 PtGH1（GH131 家族糖苷水解酶）和 PtCBM1（含 expansion-like 结构域的碳水化合物结合模块蛋白）进行深入研究，旨在阐明其在锈菌致病中的功能及机制。

该研究主要采用了以下关键技术方法：实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）技术分析基因表达模式；基于邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树进行进化分析；异源蛋白表达与酶活测定（DNS 法检测还原糖释放）；纤维素结合实验（microcrystalline cellulose 结合实验）及协同降解实验（Whatman No.1 filter paper 为底物）；酵母信号肽分泌检测系统（pSUC2 载体，YTK12 酵母菌株）；本氏烟草瞬时表达系统进行亚细胞定位和 Bax 诱导的程序性细胞死亡（Programmed Cell Death, PCD）抑制实验；大麦条纹花叶病毒介导的宿主诱导基因沉默（BSMV-HIGS）技术，在小麦品种 Chinese Spring（感病）和 Zhengmai 9023（中抗）中进行功能验证；组织化学染色（DAB 检测 H₂O₂积累、WGA 荧光染色观察菌丝形态）和显微定量分析。

**一、PtGH1 和 PtCBM1 在小麦-Pt 互作中的表达模式分析**

研究人员通过 qRT-PCR 分析了 PtGH1 和 PtCBM1 在亲和（Chinese Spring, CS）与非亲和（Yunmai34, YM）小麦互作组合中的表达动态。结果显示，PtGH1 在 CS 中从 6 hpi（接种后小时）起即显著上调，72 hpi 达到峰值（增幅超 20 倍），而在 YM 中表达量始终较低，提示其促进感病反应。PtCBM1 则呈现双相、基因型依赖的表达模式：6 hpi 在 YM 中偏高，12 hpi 在 CS 中升高，24–48 hpi 两者相近，72 hpi 在 YM 中急剧诱导（约为 CS 的 6 倍）。这一结果表明 PtGH1 可能促进感病宿主中的侵染，而 PtCBM1 可能具有情境依赖性作用，既参与早期感病反应，又可能涉及抗性植株中的晚期防御激活。

**二、PtGH1 和 PtCBM1 的结构与系统发育分析**

结构域分析显示，PtGH1 含有保守的 GH131 结构域，提示其参与碳水化合物降解；PtCBM1 由 N 端信号肽和 C 端 expansion EXLX1-like 结构域组成，符合 CBM 蛋白的分类特征。系统发育分析表明，PtGH1 与大豆锈菌（Phakopsora pachyrhizi）等担子菌的同源蛋白聚于同一分支，反映该家族的功能保守性；PtCBM1 则与小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）和杨树锈菌（Melampsora larici-populina）的 CBM 蛋白形成独立分支，体现锈菌物种间的进化保守性。

**三、PtGH1 具有葡聚糖酶活性并作为质外体效应子发挥功能**

酶活验证实验表明，PtGH1 能够水解大麦 β-葡聚糖产还原糖，而热失活的对照无此活性，证实其 β-葡聚糖酶活性。亚细胞定位研究显示，尽管 PtGH1 缺乏经典信号肽，但其在本氏烟草表皮细胞的质外体（apoplast）中检测到 mCherry 荧光信号，支持其通过非经典分泌途径分泌。

**四、PtCBM1 结合纤维素并增强纤维素酶活性**

纤维素结合实验证明，PtCBM1 可与微晶纤维素特异性结合，而 MBP 标签对照无此能力。协同降解实验显示，在纤维素酶反应体系中加入 PtCBM1 后，还原糖产量显著高于加入热失活 PtCBM1 的对照，表明 PtCBM1 能促进纤维素酶对纤维素的降解效率，发挥类似 expansion 的物理破坏细胞壁功能。

**五、PtCBM1 的分泌特性及亚细胞定位**

酵母分泌实验证实 PtCBM1 的信号肽具有功能性分泌能力（YTK12 酵母在 CMD-W 和 YPRAA 培养基上生长，TTC 还原呈红色）。在本氏烟草中的瞬时表达显示，PtCBM1-mCherry 分布于细胞质和细胞核，提示其可能靶向细胞内宿主组分发挥作用。

**六、PtCBM1 和 PtGH1 抑制植物免疫反应**

Bax 诱导的 PCD 抑制实验表明，PtCBM1 和 PtGH1 均能抑制本氏烟草中的程序性细胞死亡，且两者单独表达均不引起细胞死亡。这一结果提示两种蛋白具有免疫抑制活性，可能作为效应子干扰宿主的免疫响应。

**七、沉默 PtGH1 或 PtCBM1 削弱 Pt 毒力**

通过 BSMV-HIGS 技术，研究人员在 CS 和 ZM9023 小麦中分别沉默了 PtGH1 和 PtCBM1。沉默效率检测显示，PtGH1 表达量降低 58.35%–66.88%，PtCBM1 降低 62.70%–71.17%。表型观察表明，沉默植株上的夏孢子堆数量显著减少。真菌生物量测定显示，PtGH1 沉默使生物量降低 37.65%（CS）和 43.70%（ZM9023），PtCBM1 沉默降低 41.13%（CS）和 40.29%（ZM9023）。组织学分析表明，24 hpi 时沉默植株的菌丝长度显著缩短，48 hpi 时侵染面积显著减小。此外，沉默植株中 H₂O₂ 积累面积增大，病程相关基因 TaPR1 和 TaPR2 的表达水平显著上调，表明宿主防御响应增强。

**讨论与结论**

研究人员在讨论部分深入分析了 PtGH1 和 PtCBM1 的致病机制及其在锈菌中的功能意义。PtCBM1 虽无酶活性，但能通过结合纤维素并增强纤维素酶活性来物理性地 modify（修饰）宿主细胞壁，其功能类似于其他病原菌中的 expansion-like 蛋白；同时其细胞核定位暗示其可能调控免疫相关转录。PtGH1 则通过 β-葡聚糖酶活性酶解 callose（胼胝质）等 β-葡聚糖，破坏宿主的结构性防御。两种蛋白均能抑制 Bax 诱导的细胞死亡，体现了免疫抑制功能。沉默实验表明两者均为 Pt 完全毒力所必需，说明 Pt 采用物理辅助和酶促降解的双重策略 overcome（克服）宿主免疫。

研究人员特别指出，这种 bifurcated（分叉的）毒力策略——PtCBM1 的类 expansion 机制与 PtGH1 的酶解作用——的协同作用，使锈菌能够高效定植小麦。这一发现不仅拓展了对锈菌致病机制的理解，也为识别持久抗性育种靶标提供了新思路。由于植物可能存在识别 PtGH1 和 PtCBM1 的模式识别受体（Pattern-Recognition Receptors, PRRs），未来研究可探索利用这些毒力因子激发宿主免疫，为开发新型病害防控策略奠定理论基础。

**研究结论**：该研究系统阐明了 CBM 和 GH 家族成员在 Pt 中的功能角色。PtCBM1 和 PtGH1 代表了分叉的毒力策略：前者通过类 expansion 机制修饰宿主细胞壁并抑制植物免疫，后者通过酶解结构性多糖促进菌丝穿透。这些效应子的独立但协同作用使锈菌能够成功定植小麦。这些机制的阐明为锈菌致病机理提供了深入见解，并识别了可用于开发新型病害控制策略的潜在靶标。该论文发表于《Phytopathology Research》。