猪支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）/2型猪圆环病毒（Porcine Circovirus Type 2，PCV2）二联疫苗对猪实验性猪支原体感染的免疫原性及保护效力评价

《Veterinary Research》：Immunogenicity and efficacy of a Mycoplasma hyopneumoniae/porcine circovirus type 2 combination vaccine against experimental Mycoplasma hyopneumoniae infection in pigs

　　

摘要：疫苗接种是防控猪气喘病（enzootic pneumonia，由猪支原体Mycoplasma hyopneumoniae引起）的重要措施。本研究评估了含灭活猪支原体与2d型猪圆环病毒（Porcine Circovirus Type 2d，PCV2d；商品名Cirbloc?M Hyo，Ceva）的二联疫苗免疫仔猪后，局部与全身性体液及细胞介导免疫（Cell-Mediated Immunity，CMI）应答及其对猪支原体攻毒后的保护效力。将45头仔猪分为三组：未免疫攻毒组（C组，n=20）、免疫攻毒组（V组，n=20）及未免疫未攻毒阴性对照组（NC组，n=5）。免疫组于第0天（D0）单次肌注疫苗，各组于第21天（D21）气管内接种猪支原体强毒进行攻毒。V组与C组各取4头于攻毒后2周（D35）剖检，其余于攻毒后4周（D49）剖检，不同时间点采集血液、肺组织、支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF）及支气管淋巴结。结果显示，V组仔猪于D21和D35发生血清阳转，且D35时BALF中猪支原体特异性免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）水平显著升高。此外，V组外周血在第7天出现干扰素（Interferon，IFN）-γ+/肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）-α+CD4+CD8α+T细胞的活化及T细胞增殖，该应答持续至D21。C组BALF中白细胞介素（Interleukin，IL）-1β、TNF-α、C-X-C基序趋化因子配体8（C–X–C Motif Chemokine Ligand 8，CXCL-8）及IL-17A浓度在D49更高，且与较高的猪支原体DNA载量相关。免疫猪临床体征及肺病变程度较轻。综上，该二联疫苗可诱导强烈的猪支原体特异性体液与细胞免疫应答，并增强引流淋巴结感染后局部细胞免疫，证实其具有保护效力。

论文解读：猪支原体/2型猪圆环病毒二联疫苗对猪实验性猪支原体感染免疫原性与保护效力的评估

研究背景与目的

猪支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，M. hyo）是猪地方性肺炎（enzootic pneumonia）的原发性病原，也是猪呼吸道疾病综合征（Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC）的重要成员，可致慢性咳嗽、生长迟缓及显著经济损失。现行灭活苗虽广泛应用，但仅提供部分保护，无法完全阻止定植与传播，且既往对含M. hyo与PCV2（Porcine Circovirus Type 2）的二联疫苗研究多聚焦生产性能改善，缺乏对系统性及呼吸道局部（特别是引流淋巴结与BALF）体液与细胞介导免疫（Cell-Mediated Immunity，CMI）的全面评估。为阐明二联疫苗（含灭活M. hyo株2940与PCV2d ORF2衣壳蛋白，Cirbloc^?M Hyo，Ceva）诱导的局部与全身免疫特征及攻毒后保护机制，研究人员设计本实验性感染研究，并于《Veterinary Research》发表。

主要关键技术方法

研究人员选用确认M. hyo、PRRSV及APP阴性的无特定病原（SPF背景）Naima×Piétrain仔猪45头，按体重与性别分层随机分为三组：未免疫攻毒组（C组，n=20）、免疫攻毒组（V组，单次肌注2 mL二联疫苗，n=20）及未免疫未攻毒阴性对照（NC组，n=5）。V/C组于D21经气管接种M. hyo强毒株F7.2C与F1.12A混合菌液，NC组接种空白培养基。分别于D0、D7、D21、D35、D49采血；D7、D35、D49收集BALF；D35与D49剖检采集肺组织及支气管淋巴结（Bronchial Lymph Node，BLN）。检测指标包括：每日记录呼吸道评分（Respiratory Disease Score，RDS）；大体与组织学肺病变评分；BALF中M. hyo DNA载量（qPCR）；血清与BALF中M. hyo特异性IgG/IgA（间接ELISA及阻断ELISA）；BALF中细胞因子/趋化因子（IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、CXCL-8、IL-17A，多重免疫荧光或ELISA）；外周血单个核细胞（PBMC）及BLN细胞经M. hyo抗原体外刺激后，流式细胞术检测CD3⁺CD4⁺CD8α⁺T细胞、CD8α⁺NK样细胞等亚群胞内IFN-γ/TNF-α及增殖（CellTrace）；肺组织IgA免疫组化。统计学采用Mann–Whitney U检验、线性混合模型及Pearson相关分析。

研究结果

临床体征、肺病变及M. hyo载量（Clinical signs, lung lesions, and M. hyopneumoniae load）

V组自攻毒后D36至D49的RDS显著低于C组（P=0.03），D49时BALF中M. hyo DNA载量亦显著更低（P=0.001）。大体与显微肺病变评分两组无统计学差异（P=0.142），但V组均值较低。V组内M. hyo DNA载量与RDS及大体病变呈中度正相关。表明疫苗减轻咳嗽并降低下呼吸道病原负荷。

疫苗接种增强血清与BALF中M. hyo特异性抗体应答（Vaccination enhanced M. hyopneumoniae-specific antibody responses in serum and BALF）

V组D21有7/20头血清阳转（C组0），D35全数阳转（C组仅2/20），差异显著（P<0.001）。D35时V组BALF中M. hyo特异性IgA（P=0.005）与IgG（P=0.02）水平均显著高于C组，提示肌注疫苗可通过"prime–pull"机制诱生呼吸道局部黏膜抗体。

疫苗接种降低局部促炎细胞因子产生（Vaccination reduced local cytokine production）

D49时C组BALF中IL-1β（P=0.015）、TNF-α（P=0.043）、CXCL-8（P=0.027）及IL-17A（P<0.001）浓度均显著高于V组，IL-10无显著差异（P=0.07）。C组中IL-1β与RDS呈弱正相关，V组中IL-1β与RDS及大体病变呈中度正相关；C组IL-17A与显微病变呈弱正相关。说明疫苗抑制攻毒后过度的局部炎症反应。

疫苗接种诱发细胞介导免疫（Vaccination triggered cell-mediated immunity）

D7时V组PBMC中IFN-γ⁺/TNF-α⁺CD4⁺CD8α⁺T细胞（P=0.026）、TNF-α⁺CD3^?CD8α⁺（NK样）细胞（P=0.002）及TNF-α⁺CD3^?CD4^?CD8α^?（推测为活化B/NK样）细胞比例显著高于C组，该增殖（CD3⁺T细胞）持续至D21（P<0.001）。BLN中D49时V组有CD4⁺CD8α^?IL-17A⁺T细胞及CD8α⁺T细胞增殖升高趋势，而C组TNF-α⁺CD3^?CD4^?CD8α^?细胞更高（P=0.016），提示疫苗在引流淋巴结也激活了特异性CMI。

感染诱导两组局部黏膜免疫（Local mucosal immunity was induced in both groups upon infection）

肺组织IgA免疫组化显示两组%D49 IgA⁺面积均高于NC组但组间无显著差异，V组与大体病变呈弱正相关，提示局部黏膜IgA可随感染/病变程度上调。

讨论与结论总结

该研究首次综合评估了M. hyo/PCV2d二联疫苗诱导的外周血及支气管淋巴结细胞免疫与BALF局部体液免疫。单次肌注可在1周内激活多功能性CD4⁺CD8α⁺T细胞、NK样细胞及T细胞增殖，并在攻毒后提升BALF中特异性IgA/IgG、降低BALF促炎因子（IL-1β、TNF-α、CXCL-8、IL-17A），减轻咳嗽与M. hyo载量，BLN中出现IL-17A⁺CD4⁺T细胞及CD8α⁺T细胞增殖趋势。尽管大体/显微肺病变未达统计学差异，但整体病变程度减轻。研究表明该二联疫苗通过系统性及局部（引流淋巴结+BALF）免疫应答提供对M. hyo攻毒的临床保护，为猪M. hyo–PCV2联合免疫机制提供了实验依据。

结论翻译：综上所述，该二联疫苗诱导了针对猪支原体的局部与全身性特异性体液及细胞介导免疫应答，这些疫苗诱导的免疫反应在攻毒感染后减轻了临床体征并降低了猪支原体DNA载量。本研究结果表明，该二联疫苗可激发猪体内猪支原体特异性免疫应答，保护仔猪抵抗猪支原体攻毒感染引起的临床症状。