《Veterinary Research》：Pathogenesis of Brucella abortus and Brucella melitensis in bovine and ovine-derived trophoblasts and macrophages and impaired intracellular trafficking of the Rev1 vaccine strain
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布鲁氏菌属（Brucella spp.）是革兰阴性兼性胞内病原体，引起广泛的人畜共患病——布鲁氏菌病。其中，羊种布鲁氏菌（B. melitensis）和流产布鲁氏菌（B. abortus）是流行病学上最重要的物种，主要分别感染绵羊/山羊和牛。感染后，布鲁氏菌在
布鲁氏菌属（Brucella spp.）是革兰阴性兼性胞内病原体，引起广泛的人畜共患病——布鲁氏菌病。其中，羊种布鲁氏菌（B. melitensis）和流产布鲁氏菌（B. abortus）是流行病学上最重要的物种，主要分别感染绵羊/山羊和牛。感染后，布鲁氏菌在吞噬细胞内增殖并表现出胎盘趋向性，尤其靶向滋养细胞。大多数关于布鲁氏菌致病机理和疫苗开发的研究依赖于小鼠或人源的上皮和巨噬细胞系，这些模型可能无法完全再现自然反刍动物宿主的情况。本研究旨在探究布鲁氏菌在非自然宿主模型中描述的胞内行为是否也发生在反刍动物滋养细胞（AH-1和F3细胞）和巨噬细胞（BoMac细胞）中。利用共聚焦免疫荧光显微镜和细菌学检测，研究人员观察到流产布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌具有相似的感染率。感染后24小时（hours post-infection，hpi），两种细菌均转移至溶酶体相关膜蛋白1（Lysosomal-associated membrane protein 1，LAMP1）阴性的布鲁氏菌容纳空泡（Brucella-containing vacuole，BCV）中，并在钙联接蛋白（calnexin）阳性的区室内进行活跃的复制。这些结果证实，先前在非自然宿主模型中描述的布鲁氏菌胞内运输途径在这些反刍动物细胞中是保守的。此外，本研究首次表征了Rev1疫苗株的胞内行为。尽管其初始感染率与羊种布鲁氏菌16M相当，但Rev1在从BCV中排除LAMP1方面表现出延迟，在24 hpi时大多数细菌仍停留在LAMP1阳性区室中，并且显示出复制起始的延迟。这些发现，连同其较慢的体外生长，表明Rev1的减毒源于胞内运输延迟和胞内适应能力受损的双重作用。研究结果增进了对布鲁氏菌在自然宿主中致病机制的理解，并揭示了Rev1的减毒机制，为改进当前布鲁氏菌病疫苗提供了关键见解。
布鲁氏菌病是一种由布鲁氏菌属细菌引起的广泛人畜共患病。布鲁氏菌是革兰阴性、兼性胞内的球杆菌，包含多种具有不同偏好宿主的物种，其中羊种布鲁氏菌（B. melitensis）和流产布鲁氏菌（B. abortus）是流行病学上最关键的两种，分别主要感染小反刍动物和牛。目前，针对这两种菌的防控主要依赖于减毒活疫苗，如羊种布鲁氏菌Rev1和流产布鲁氏菌S19。然而，这些疫苗存在诸多局限性，例如不能提供完全保护、可能引起孕畜流产（尤其是Rev1），以及尽管毒力较低但仍能感染人类，且Rev1对用于治疗人布鲁氏菌病的链霉素具有耐药性。因此，迫切需要开发新疫苗或在保持现有疫苗保护效力的前提下改进其缺陷。评估改进的候选疫苗最终需要依赖布鲁氏菌的自然宿主动物模型，但这面临成本高、设施要求严、伦理限制等问题。尽管小鼠模型仍是主要工具，但为减少动物使用数量，开发生物学上更相关的细胞模型至关重要，这有助于评估突变对布鲁氏菌适应性的影响或用于候选疫苗的高通量筛选。胎盘外植体和类器官虽然能保留胎盘结构的关键特征，但其培养存活期短、技术难度大或三维结构限制观察等缺点，限制了其在研究细菌复制和胞内运输方面的应用。因此，体外细胞培养模型仍然是研究布鲁氏菌胞内致病机制的便捷且广泛可用的选择。
理解布鲁氏菌的胞内生命周期是建立此类细胞模型的基础。目前，相关知识主要来源于对人类HeLa上皮细胞和小鼠巨噬细胞的研究。在这些细胞中，布鲁氏菌被内化在一个称为布鲁氏菌容纳空泡（BCV）的吞噬体结构中。在感染的最初8小时内，内体性BCV（endosomal BCV， eBCV）经历未改变的内存途径，获得早期（如Rab5、EEA-1）和晚期（如LAMP1/2、CD63、Rab7）内体标志物。这些晚期内体标志物控制eBCV与晚期内存区室和溶酶体的融合，导致eBCV酸化（pH 4.5–5）并成熟为吞噬溶酶体。eBCV的酸化是关键步骤，它诱导IV型分泌系统（Type 4 Secretion System， T4SS）-VirB的表达，后者开始转运效应分子以调节宿主细胞生物学，并介导eBCV与内质网（endoplasmic reticulum， ER）和高尔基体来源的膜相互作用。因此，在感染后8至12小时，eBCV逐渐失去内体标志物并获得与ER膜相关的标志物（如钙网蛋白、钙联接蛋白、Sec61β）。由此，eBCV转化为一个ER来源的细胞器，此过程与细菌在空泡内开始复制的时间点相关，此时空泡被称为复制性BCV（replicative BCV， rBCV）。最后，在感染后48至72小时，rBCV被自噬体样结构捕获，形成多膜空泡，称为自噬性BCV（autophagic BCV， aBCV），并获得晚期溶酶体和内体区室的特征。此外，布鲁氏菌还可能利用其他与自噬相关的分泌机制（如多泡体途径或线粒体自噬）释放到细胞外环境，继续感染新细胞。
为了开发生物学上相关的细胞模型，还必须考虑布鲁氏菌的生物学和致病机理。这些细菌通过粘膜屏障进入机体，与单核吞噬细胞系统的细胞（如巨噬细胞）建立相互作用。在这些细胞内，布鲁氏菌避免被胞内杀伤并持续存在，以到达其偏好的复制器官（如脾脏或胎盘）。在胎盘中，布鲁氏菌主要靶向滋养细胞和胎儿来源的细胞，这些细胞在妊娠期间建立母胎界面。由于滋养细胞感染是导致胎盘完整性丧失进而流产的关键步骤，使用滋养细胞系可能有助于更好地理解布鲁氏菌的胞内生活/致病机理，并通过筛选大量突变体和/或候选疫苗株来促进疫苗改进。
本研究的主要技术方法包括：使用从布鲁氏菌自然宿主（绵羊和牛）分离的靶细胞系，即绵羊滋养细胞系AH-1、牛滋养细胞系F3和牛腹腔巨噬细胞系BoMac，并以人源HeLa上皮细胞作为对照。通过稳定插入绿色荧光蛋白（green fluorescent protein， GFP）基因构建荧光标记的细菌株，利用共聚焦免疫荧光显微镜观察细菌的胞内定位（如BCV的LAMP1和钙联接蛋白标志物动力学），并通过菌落形成单位（colony-forming unit， CFU）计数和基于荧光信号的图像分析来定量评估细菌的感染率、胞内运输和复制动力学。
研究结果首先证实，AH-1绵羊滋养细胞、F3牛滋养细胞和BoMac牛巨噬细胞均允许流产布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌感染。在感染后2小时，两种细菌在三种反刍动物细胞系中显示出相似的感染率（12-18%的细胞被感染），与使用10倍更高感染复数（multiplicity of infection， MOI）的HeLa细胞感染率相当。这表明这些细胞系，特别是滋养细胞，对布鲁氏菌具有高度的易感性。
关于胞内运输，研究人员发现，在反刍动物细胞系中，流产布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌的BCV LAMP1动力学特征与HeLa细胞中先前描述的经典模型一致。在感染后2小时，大多数BCV为LAMP1阳性。到感染后24小时，两种细菌的BCV均失去LAMP1标志（阳性率低于20%），并开始在与ER相关的钙联接蛋白阳性区室内进行显著复制。到感染后48小时，LAMP1阳性率接近零，细菌在钙联接蛋白阳性的BCV中大量复制。作为对照，VirB系统缺陷的突变体（Bm16MΔvirB）在所有细胞系中均无法脱离LAMP1阳性区室，也不能建立钙联接蛋白阳性的复制区室，证实功能性T4SS-VirB对于布鲁氏菌成功建立复制生态位至关重要。
在复制能力方面，CFU计数显示，流产布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌在四种细胞系中均能大量复制。流产布鲁氏菌在总菌落数上显示出更大的增长，而羊种布鲁氏菌则在牛滋养细胞和HeLa细胞中诱导了更高比例的允许复制的感染细胞（即细胞内细菌数量>10的细胞类别）。这种物种间和细胞系间的差异表明，细菌的胞内行为不仅取决于其固有特性，也受到宿主细胞类型和状态的影响。
本研究首次系统地表征了Rev1疫苗株的胞内行为。尽管Rev1的初始感染率与其亲本株羊种布鲁氏菌16M相当，但其在从BCV中排除LAMP1方面表现出显著延迟。在感染后24小时，大部分Rev1细菌仍滞留在LAMP1阳性区室中，其复制起始也相应延迟。此外，Rev1的体外生长速度较慢，总生物量较低。在胞内复制方面，Rev1的总细菌数量和复制速率均显著低于羊种布鲁氏菌16M。然而，Rev1最终仍能到达钙联接蛋白阳性的复制区室并进行复制，尽管其复制水平较低。这些结果表明，Rev1的减毒是由于其胞内运输延迟和胞内适应能力受损共同导致的。
在讨论部分，研究人员指出，尽管人类HeLa细胞和小鼠巨噬细胞模型在阐明布鲁氏菌胞内生命周期基础方面具有不可否认的价值，但使用从自然反刍动物宿主获得的细胞培养物作为模型，可能更能反映这种动物病原体的生物学相关性。本研究所用的反刍动物滋养细胞和巨噬细胞系已被成功用于研究其他具有生殖趋向性的胞内病原体，这支持了它们作为布鲁氏菌研究模型的适用性。研究发现，在反刍动物细胞系中，布鲁氏菌的感染效率可能更高（使用更低的MOI达到与HeLa细胞相似的感染率），这可能与滋养细胞在体内的吞噬能力及其作为布鲁氏菌特异性靶点的特性有关。研究观察到流产布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌在复制策略上存在差异（前者总菌量高，后者复制允许细胞比例高），这可能反映了物种间的不同基因组背景，同时也受到宿主细胞特性的影响。这种差异在之前使用人滋养细胞系的研究中也有报道，提示不同滋养细胞模型的功能异质性可能调节布鲁氏菌的胞内命运。因此，AH-1和F3细胞可能代表不同的滋养细胞状态，可作为互补模型用于研究布鲁氏菌的胞内行为。
关于Rev1疫苗，其减毒基础此前并未完全阐明。本研究揭示了其胞内运输延迟和复制能力下降是减毒的关键机制。尽管Rev1能够最终建立复制生态位并进行复制，但其效率降低。这种有效的胞内复制能力与其在生殖道中的高毒力和致流产效应是一致的，这凸显了开发更安全、同时保持效力的疫苗的必要性。此外，研究还发现，尽管流产布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌各有其典型的宿主偏好，但两者在测试的滋养细胞和巨噬细胞中均能有效感染和复制，未发现明显的物种限制性差异。这表明，在存在流行病学机会的情况下，两种菌都能在非典型宿主中引发疾病。
研究结论是，流产布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌在反刍动物滋养细胞和巨噬细胞中保守地遵循先前描述的胞内运输途径，并能够大量复制，这验证了这些细胞系作为研究布鲁氏菌胞内致病机制的生物学相关模型的适用性。此外，Rev1疫苗株的减毒源于胞内运输延迟和胞内适应能力受损。这些发现增进了对布鲁氏菌自然宿主致病机制的理解，并阐明了Rev1的减毒机制，为改进当前布鲁氏菌病疫苗提供了关键见解。
