《Veterinary Research》：Characterization of a novel gene, Lsa(F), conferring resistance to pleuromutilins, lincosamides and streptogramin A in Streptococcus parasuis
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可转移性抗菌药物耐药性对公共卫生构成重大威胁。由Lsa同源物介导的对截短侧耳素类、林可酰胺类和链阳菌素A的耐药性进一步加剧了这一问题。本研究旨在表征在猪副链球菌（Streptococcus parasuis）中鉴定到的一种新型PLSA耐药基因，命名为Lsa(F
可转移性抗菌药物耐药性对公共卫生构成重大威胁。由Lsa同源物介导的对截短侧耳素类、林可酰胺类和链阳菌素A的耐药性进一步加剧了这一问题。本研究旨在表征在猪副链球菌（Streptococcus parasuis）中鉴定到的一种新型PLSA耐药基因，命名为Lsa(F)。Lsa(F)蛋白与已知Lsa变体之间的序列一致性为41.9–58.7%，并具有ATP结合盒（ABC，ATP-binding cassette）蛋白超家族F谱系中介导核糖体保护的典型结构特征。Lsa(F)在猪链球菌（Streptococcus suis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中的功能性表达可赋予对PLSA的耐药性。尽管Lsa(F)基因在S. parasuis分离株中的流行率相对较低，但数据库分析显示该基因主要存在于Streptococcus和Lactococcus属物种中。在Streptococcus中，Lsa(F)基因主要与多种移动遗传元件（MGEs，mobile genetic elements）相关，包括质粒、整合接合元件（ICE，integrative and conjugative elements）以及ICE衍生元件；在Lactococcus中，该基因主要定位于质粒和一个特定的染色体位点。遗传环境分析发现，几乎所有染色体MGEs和质粒上的Lsa(F)下游均存在插入序列ISLll1，提示其可能是促进该基因移动的潜在机制。值得注意的是，研究结果表明Lsa(F)基因能够由S. parasuis转移至猪链球菌（Streptococcus suis），提示其向其他病原体扩散的风险。因此，有必要加强对Lsa(F)基因的监测与流行病学追踪，以降低其传播所带来的潜在公共卫生风险。
该文发表于《Veterinary Research》，围绕一种新发现的ABC-F家族耐药基因Lsa(F)展开系统研究，重点解析其在猪副链球菌（Streptococcus parasuis）中的分子特征、耐药表型、遗传载体分布及水平传播潜力。研究背景在于，抗菌药物耐药性已成为全球公共卫生和兽医领域的共同挑战，尤其是可转移耐药基因依赖移动遗传元件（MGEs，mobile genetic elements）在不同菌种间扩散，会显著削弱关键抗感染药物的临床和兽医应用价值。截短侧耳素类药物在兽医领域广泛用于猪和禽类感染防治，而其衍生物瑞他帕林（retapamulin）和来法木林（lefamulin）已进入人用临床。由此，动物和人类领域的共同用药背景为相关耐药基因的筛选与扩散提供了生态基础。既往研究已表明，ATP结合盒F家族蛋白（ABC-F，ATP-binding cassette F family）可通过核糖体保护机制介导对多类抗菌药物的耐药，但新的变体仍在不断被发现。研究人员在一株对泰妙菌素耐药、却缺乏已知耐药决定子的S. parasuis菌株中发现异常现象，由此开展了本项研究。
现有问题主要包括：第一，部分菌株可表现出对PLSA药物即截短侧耳素类（pleuromutilins）、林可酰胺类（lincosamides）和链阳菌素A（streptogramin A）的耐药，但其分子基础尚不明确；第二，既有生物信息学分析虽然曾简略提及一个Lsa变体，但缺少实验验证，无法确认其是否真正具备耐药功能；第三，这类新型耐药基因是否可借助整合接合元件、质粒或其他遗传结构在链球菌及相关菌属中传播，仍缺乏系统认识。因此，阐明这一新基因的功能、分布、遗传环境和可转移性，对于评估兽医源耐药因子的公共卫生风险具有现实必要性。
研究人员首先以临床分离的26株S. parasuis为基础材料，对其中一株SFJ45进行了重点分析。该菌株来源于2017年猪鼻拭子样本，既往已完成基因组测序与耐药谱分析。研究发现，SFJ45的泰妙菌素耐药性并非由已知23S rRNA、rplC或rplD突变，也非由已知相关耐药基因解释。进一步通过接合转移实验、全基因组分析和功能克隆表达，研究人员确认一个先前称为Lsa_var2的ABC-F家族基因可介导PLSA耐药，并将其正式命名为Lsa(F)。该研究最终得出结论：Lsa(F)是一种新型可转移PLSA耐药基因，具备典型ABC-F家族核糖体保护蛋白的结构特征，能够在异源宿主中提高多种PLSA药物的最低抑菌浓度（MIC，minimum inhibitory concentration），并与多种MGEs紧密相关，存在跨菌种传播风险。其重要意义在于，该发现扩展了Lsa同源耐药决定子的谱系范围，并提示在“同一健康”（One Health）框架下应加强对动物源耐药基因的持续监测。
本研究主要采用以下关键技术方法：研究人员对26株临床S. parasuis分离株进行聚合酶链式反应（PCR，polymerase chain reaction）鉴定与耐药基因筛查，并通过肉汤微量稀释法测定多种PLSA相关药物的MIC；将含自身启动子的Lsa(F)片段克隆入穿梭载体pSET2，并转化至猪链球菌P1/7和金黄色葡萄球菌RN4220以验证功能；结合全基因组序列、生物信息学比对、系统发育分析、遗传环境比较及数据库检索，解析Lsa(F)的结构特征、系统分布和MGEs关联；同时利用滤膜接合实验评估Lsa(F)自S. parasuis向S. suis的转移能力。样本队列来源包括实验室保存的26株临床S. parasuis分离株，并补充纳入GenBank数据库中Lsa(F)阳性菌株。
以下为研究结果的分项解读。
Characterization of the Lsa(F) gene
研究人员首先在S. parasuis SFJ45中追踪泰妙菌素耐药决定子。接合实验显示，以林可霉素作为筛选标记时，部分受体菌获得了泰妙菌素耐药表型，提示相关决定子具有可转移性。基因组分析发现，SFJ45在fda位点存在串联排列的ICESpsuSFJ45和CIME45两个元件，其中ICE携带optrA和erm(B)，CIME携带mdt(A)。只有ICE与CIME共同转移时才出现泰妙菌素耐药，说明未知耐药基因位于CIME45内。进一步分析鉴定到一个编码526个氨基酸的ABC-F型核糖体保护蛋白基因。系统发育树显示，该蛋白聚类于含Lsa同源物和Eat(A)的谱系中；氨基酸比对表明其与已知Lsa变体的一致性为41.9–58.7%。结构上，该蛋白具有两组Walker A基序、Walker B基序、ABC signature基序和H-loop switch，且缺乏跨膜结构域，符合ABC-F家族典型特征。据此，研究人员将其命名为Lsa(F)。
Resistance phenotype conferred by the Lsa(F) gene in S. suis and S. aureus
为验证Lsa(F)的功能，研究人员将其连同自身启动子克隆入pSET2，并转入S. suis P1/7和S. aureus RN4220。MIC测定结果表明，携带Lsa(F)后，两种宿主对截短侧耳素类药物的MIC均显著升高，至少增加8倍；其中对泰妙菌素的MIC升高达128倍。对仅限人用的瑞他帕林和来法木林，两种宿主中的MIC均升高64倍。此外，转化子对林可霉素、克林霉素及维吉尼亚霉素M
1的MIC也明显升高，最少分别增加32倍和4倍。该结果直接证明Lsa(F)可赋予典型PLSA耐药表型，且不仅在链球菌中有效，在葡萄球菌中同样具有功能表达能力。
Prevalence of the Lsa(F) gene
在26株临床S. parasuis中，19株对泰妙菌素MIC较高。PCR筛查显示，其中10株携带Lsa(F)，9株携带Lsa(E)；另有2株Lsa(F)阳性菌同时携带cfr。表型与基因型总体一致。Lsa(F)阳性菌株分离自中国江苏、浙江和贵州三省，时间跨度为2016–2025年。为扩大分析范围，研究人员进一步检索公共数据库，发现Lsa(F)还存在于少量Streptococcus和Lactococcus菌株中，包括若干S. parasuis、原注释为S. suis的菌株以及Streptococcus pluranimalium。核心基因组系统发育分析进一步指出，数据库中Lsa(F)阳性的所谓S. suis菌株实际应归类为S. parasuis，这也反映出相关菌种在既往研究中存在误鉴定问题。总体而言，Lsa(F)主要分布于Streptococcus和Lactococcus，但流行率较低，提示其可能尚处于扩散早期阶段。研究还注意到一种Lsa(F)-like基因，其编码蛋白与Lsa(F)一致性为81.2%，但其耐药功能尚待进一步验证。
Characterization of the Lsa(F) genetic context and its associated mobile genetic elements
研究人员对Lsa(F)周围50 kb区域进行了遗传环境分析。在S. parasuis中，大多数Lsa(F)阳性菌株的该基因位于整合至染色体背景的MGEs上，包括ICE、CIME、基因组岛（GI，genomic island）及缺陷型ICE（dICE，defective ICE）。这些元件主要整合于fda位点，该位点被认为是ICESt3家族ICE的整合热点。携带Lsa(F)的ICE具有类似ICESt3的重组、接合和调控模块“核心”结构，但核苷酸一致性较低；其可变区常与多种耐药基因和插入序列共存，提示共选择和IS介导移动的可能性。部分短contig虽无法完整解析背景，但也提示Lsa(F)存在于多样遗传载体中。在S. pluranimalium中，Lsa(F)可位于RepB家族质粒上，并与lnu(A)共存；另有序列提示其可能也存在于质粒片段上。在Lactococcus中，Lsa(F)既可位于RepX或RepB家族质粒，也可位于染色体budC与maeA之间的特定位点，部分情况下可能因邻近IS元件丢失而稳定固着于染色体。上述结果说明，Lsa(F)具有显著的载体多样性和跨属传播基础。
研究还特别分析了与Lsa(F)相关的插入序列。在部分S. parasuis菌株中，Lsa(F)邻近存在IS3和IS6家族转座酶，提示其可能参与复合转座子形成。更重要的是，在几乎所有位于染色体MGEs或质粒上的Lsa(F)下游，均可见ISLll1。该保守结构单元由上游假定蛋白基因hyp、Lsa(F)以及下游ISLll1构成，即hyp–Lsa(F)–ISLll1，全长3135 bp。ISLll1属于IS982家族，长999 bp，含有一个891 bp的DDE型转座酶开放阅读框，末端反向重复序列具有已知ISLll1成员一致的特征。虽然未观察到典型靶位点重复，但其高度保守的下游定位支持其可能参与Lsa(F)的转座与扩散。
Transferability of Lsa(F) from S. parasuis to S. suis
滤膜接合实验进一步证实，3株Lsa(F)阳性S. parasuis供体菌HCJ31、SFB2和SFJ45均可将相关遗传元件转移至S. suis P1/7RF。PCR证实所有转接合子中的Lsa(F)相关元件均整合于受体菌fda位点。获得元件后，转接合子对截短侧耳素类、林可酰胺类和链阳菌素A的敏感性均明显下降。不同供体中，Lsa(F)分别位于ICE或CIME上；在SFJ45中，CIME的转移依赖同位点ICE介导的顺式动员。相较之下，位于dICE或ICE衍生GI中的Lsa(F)在缺乏完整转移起始位点oriT时难以实现接合转移。该结果表明，Lsa(F)不仅具备功能性耐药作用，而且在合适MGEs背景下具备种间传播能力。
Discussion
讨论部分指出，ABC-F家族蛋白常介导一类或多类抗菌药物耐药，代表性成员如OptrA和PoxtA已显示出动物用药与人用关键药物之间的交叉耐药风险。Lsa(F)作为新鉴定的Lsa同源变体，可介导对三类核糖体靶向药物即PLSA的耐药。尤其值得重视的是，Lsa(F)可降低对4种截短侧耳素类药物的敏感性，其中瑞他帕林和来法木林属于人用药物，而泰妙菌素和沃尼妙林主要用于兽医。长期兽医用药选择压力可能促进Lsa(F)在动物源菌群中的持续存在和扩散，一旦其水平转移至人类病原菌，将可能削弱相关药物的临床疗效。
讨论还强调，已知Lsa变体中，Lsa(E)宿主范围最广，而本研究发现Lsa(F)目前主要见于Streptococcus和Lactococcus，提示其分布尚有限。尽管如此，S. parasuis和S. pluranimalium等机会性人畜共患相关菌种中，Lsa(F)与ICE、CIME、GI、dICE和质粒等MGEs密切相关，这种遗传背景可能有利于后续扩散。在Lactococcus中，虽然该属通常被视为非致病且有益的乳酸菌，但若其携带的Lsa(F)通过质粒或其他方式流向食源性病原菌，同样值得警惕。关于其移动机制，研究人员认为ISLll1可能在Lsa(F)于不同MGEs之间的重组和转座中发挥关键作用，这一点与其他ABC-F耐药基因常由IS元件介导迁移的规律相一致。
研究结论部分可译述为：总之，本研究首次在动物源猪副链球菌分离株中鉴定出新型PLSA耐药基因Lsa(F)。被ISLll1侧邻的Lsa(F)的出现提示其具有潜在可移动性。Lsa(F)基因经常与多种移动遗传元件相关联。尽管目前检出率相对较低，但这种遗传背景可能显著增加其传播风险。尤其是，Lsa(F)常与其他抗菌药物耐药基因（ARGs，antimicrobial resistance genes）共存，因此，从“同一健康”（One Health）视角出发，持续监测该基因的流行和传播至关重要。
