植物黄油基纳米载体：纳米颗粒化与槲皮素负载是否调节与创面愈合相关的体外细胞效应？

《AAPS PharmSciTech》：Vegetable Butter-Based Nanocarriers: Do Nanoparticulation and Quercetin Loading Modulate In vitro Cellular Effects Involved in Wound Healing?

　　

对慢性皮肤创面开发先进且具有成本效益的局部治疗策略的需求，推动了本研究对基于乳木果脂或可可脂的纳米结构脂质载体（NLCs）的评估。研究人员的第一个目标是将NLCs与传统乳剂进行比较，以评估黄油纳米颗粒化是否为创面相关应用带来生物学优势。研究人员采用热均质-超声法制备NLCs，并从粒径、多分散指数、形貌和稳定性等方面进行表征。两种黄油基NLCs均形成稳定、单分散的纳米级系统（粒径197–240 nm，PDI＜0.2）。在HaCaT角质形成细胞中，与各自乳剂相比，乳木果脂和可可脂基NLCs均显著增强细胞增殖（乳木果脂最高达137%，可可脂最高达127%）和创伤再填充（分别最高达96%和65%）。研究人员的第二个目标是评估槲皮素（QT）掺入NLCs后的影响，因为氧化应激已被证实与愈合困难相关。QT的掺入并未进一步增加细胞增殖或再填充，但显著改善了抗氧化保护，在12 μg/mL QT条件下，可使H₂O₂诱导的细胞内活性氧（ROS）最高降低53–62%。乳木果脂基NLCs表现出更优越的生物学性能，包括适度的内在抗氧化效应（约15%的DPPH抑制），这可能归因于内源性脂质生物活性成分。QT负载的乳木果脂NLCs促进了QT在受损猪皮肤角质层中的滞留增加（约14 vs. 约9 μg/cm²）以及在真皮中的滞留增加（约9 vs. 约3 μg/cm²），同时限制其透过。上述结果表明，植物黄油基NLCs，尤其是乳木果脂来源NLCs，是一种有前景的创面管理平台，能够结合脂质本征生物活性、纳米尺度介导的药物可及性以及皮肤屏障支持作用。

该论文发表于《AAPS PharmSciTech》，围绕慢性创面局部治疗中“载体结构是否本身具有治疗价值”这一关键问题展开，研究重点不只是槲皮素（quercetin，QT）递送，更在于验证植物黄油经纳米颗粒化后能否比传统乳剂更有效地调节与创面愈合相关的细胞行为。创面愈合是止血、炎症、增殖和重塑等阶段相互重叠的复杂过程，而慢性创面由于氧化应激持续、炎性信号异常、角质形成细胞迁移和增殖受损、胶原沉积不足及屏障修复迟缓，往往难以进入正常愈合轨道。与此同时，糖尿病足、静脉性溃疡、压疮等慢性创面的医疗负担巨大，因此亟需兼具疗效、成本可控和局部适用性的创新给药体系。研究人员据此选择纳米结构脂质载体（NLCs）作为平台，原因在于其兼具脂质生物相容性、对疏水活性物的增溶与保护、局部滞留能力以及封闭保湿特性；同时选用乳木果脂与可可脂作为脂质基质，是因为二者不仅具有药用和皮肤科应用历史，还具有屏障支持、润肤以及潜在生物活性。乳木果脂富含不皂化组分、三萜类和生育酚，可可脂则含有脂肪酸与抗氧化成分，因此它们既是载体材料，也可能直接影响创面微环境。另一方面，QT虽具有明确的抗氧化与潜在促修复作用，但受限于水溶性差、化学稳定性不足与皮肤生物利用度低，其临床转化仍受阻。基于这些问题，本研究试图同时回答两个问题：其一，植物黄油纳米颗粒化后是否优于传统乳剂；其二，QT负载后是否进一步提升创面相关生物学效应。

方法上，研究人员采用热均质-探头超声法制备以乳木果脂或可可脂为固体脂质、辛酸/癸酸甘油三酯为液体脂质的NLCs，利用动态光散射（DLS）、电泳光散射（ELS）和透射电子显微镜（TEM）进行理化表征，并考察30 d稳定性；以HaCaT人永生化角质形成细胞开展磺酰罗丹明B（SRB）增殖实验、划痕愈合实验、H₂O₂诱导活性氧（ROS）检测和胶原定量；通过DPPH自由基清除实验评价抗氧化性；进一步在离体猪耳损伤皮肤Franz扩散池模型中评估QT皮肤滞留、透过行为及经皮水分丢失（TEWL）。离体皮肤样本来源于当地屠宰场猪耳。

研究结果首先体现在制剂构建与理化性质优化方面。

Formulation Development and Physicochemical Characterization of Nanostructured Lipid Carriers
研究人员首先优化超声时间和表面活性剂条件，以获得粒径150–300 nm、PDI＜0.3的均一纳米体系。结果显示，延长超声时间可降低乳木果脂NLCs粒径和PDI，10 min为较优工艺。随后比较Poloxamer 188与Tween 80后发现，Tween 80更有利于形成更小粒径体系：乳木果脂NLCs在1% Tween 80时获得较佳粒径和分散性；可可脂NLCs在2% Tween 80时粒径更符合目标范围。优化后的两类NLCs在室温下30 d内粒径与PDI无显著变化，显示良好胶体稳定性。与传统乳剂相比，NLCs粒径显著更小、分布更均一：乳木果脂乳剂约1231.6 nm，而对应NLC约241.1 nm；可可脂乳剂约2939.3 nm，而对应NLC约197.4 nm。QT负载后，两类NLC粒径均略有增加，但PDI与Zeta电位未发生显著不利变化，Zeta电位整体维持在约?20至?30 mV。TEM显示颗粒多呈球形，未见明显大聚集体或游离QT晶体。QT载入后，乳木果脂NLC的关联效率约为46.0%–64.8%，可可脂NLC约为66.7%–78.2%；综合粒径、PDI与载药表现，研究人员最终选择0.05%（w/w）QT处方进入后续生物学评价。

The SRB Assay Revealed Enhanced Proliferative Capacity of HaCaT Cells Treated with NLCs Compared to Emulsions, with Distinct Effects Depending on the Vegetable Butter
在细胞增殖评价中，研究人员比较了传统乳剂、空白NLCs、QT负载NLCs及游离QT的作用。结果表明，乳木果脂和可可脂两类空白NLCs均优于相应乳剂。乳木果脂空白NLCs在低至中等脂质量浓度下可使HaCaT增殖达到约127%–137%，而对应乳剂不显示促增殖作用，且在高浓度时明显抑制细胞生长。可可脂空白NLCs亦产生约121%–127%的增殖提升，而乳剂在较高浓度下则出现明显抑制甚至负值结果。这说明载体纳米结构而非单纯脂质含量决定了更有利的细胞反应。QT负载后，NLCs总体维持原有促增殖能力，乳木果脂QT-NLCs约为121%–141%，可可脂QT-NLCs约为109%–125%；相较之下，游离QT未引起明显促增殖效应。

The Wound Scratch Assay Revealed Enhanced Wound Repopulation Capacity of Hacat Cells Treated with NLCs Compared to Emulsions, with Formulation-Dependent Effects Related to Vegetable Butter Type
划痕实验用于评价创面再填充能力。由于实验未加入抗有丝分裂剂，因此所观测到的闭合效应综合反映了细胞增殖和迁移。结果显示，乳木果脂体系中，空白NLCs与乳剂均可促进伤口闭合，但高浓度下空白NLCs效果更强，创面再填充约96%，显著高于相应乳剂约76%。QT掺入后并未进一步显著提升该指标。可可脂体系中也观察到类似趋势，空白NLCs在较高脂质浓度下使再填充提升至约65%，高于乳剂约45%。该结果进一步证明，植物黄油经纳米颗粒化后，相比常规乳剂更能促进与再上皮化相关的细胞行为。基于此，后续实验仅保留植物黄油NLCs进行深入评价。

The ROS Assay Revealed a Protective Antioxidant Effect of Quercetin-Loaded NLCs Against H₂O₂-Induced Oxidative Stress in Hacat Cells, with Formulation-Dependent Effects Related to Vegetable Butter Type
在H₂O₂诱导氧化应激模型中，QT负载NLCs表现出明确的浓度依赖性ROS抑制作用。乳木果脂QT-NLCs在12 μg/mL QT时可降低细胞内ROS约53%，在6–3 μg/mL时降低约40%–26%；游离QT虽也具一定抗氧化性，但整体幅度略低。空白乳木果脂NLCs在高浓度下仍显示不足21%的轻度ROS抑制。可可脂QT-NLCs在12 μg/mL时可将ROS降低约62%，6 μg/mL时约49%，3–1.5 μg/mL时约28%–36%；而空白可可脂NLCs几乎不具清除能力。由此可见，QT掺入的主要增益体现在抗氧化保护，而非进一步促进增殖或划痕闭合。

The DPPH Assay Confirmed the Antioxidant Activity of Quercetin-Loaded Shea Butter–Based NLCs
为确认QT在制剂中的抗氧化活性未丧失，研究人员进一步以乳木果脂NLCs进行DPPH自由基清除实验。游离QT呈浓度依赖性清除自由基，IC₅₀为3.70 μg/mL；当选取20 μg/mL条件时，QT负载乳木果脂NLCs几乎实现完全自由基抑制，说明制剂总体上保留了QT的抗氧化性质。此外，空白乳木果脂NLCs也呈现约10%–15%的DPPH抑制，提示乳木果脂基质自身具有温和内在抗氧化能力，这与其内源性生育酚和三萜类活性成分相一致。

Collagen Quantification Revealed a Modest Increase in Collagen Production in HaCaT Cells Treated with Quercetin-loaded NLCs, Depending on Vegetable Butter Type
胶原定量结果显示，QT负载NLCs在较高浓度下可轻度提升胶原相关指标。乳木果脂QT-NLCs在12 μg/mL时使胶原生成增加约49%，可可脂QT-NLCs在同浓度下增加约26%；而空白NLCs与游离QT均未引起显著变化。该结果提示，QT经NLC递送后对基质重塑相关过程具有一定促进作用，但整体效应较增殖、再填充和抗氧化结果更为温和。由于乳木果脂体系总体表现更优，研究人员将其确定为后续离体皮肤研究对象。

The ex vivo Skin Experiments Revealed Enhanced Cutaneous Retention and Reduced Permeation of Quercetin Delivered by Shea Butter–Based NLCs
在猪耳线性切割损伤皮肤Franz扩散池模型中，乳木果脂QT-NLCs显著提高了QT在角质层和表皮/真皮中的局部滞留，同时减少向受体液的透过。具体而言，NLCs-Sb-QT使QT在角质层中的滞留提高至约14 μg/cm²，高于游离QT约9 μg/cm²；在表皮+真皮中的滞留约9 μg/cm²，显著高于游离QT约3 μg/cm²。与此同时，NLCs-Sb-QT向受体液的透过可忽略，提示其更有利于维持局部药物富集而非系统暴露。此外，空白乳木果脂NLCs显著降低完整皮肤TEWL，不仅优于水对照，也优于商业制剂Fisiogel?，说明其具备良好的封闭保湿和屏障支持作用。这一点对于慢性创面尤为重要，因为维持湿润微环境有利于角质形成细胞迁移、上皮化和修复进程。

讨论部分的核心在于两点。其一，植物黄油纳米颗粒化本身确实带来了生物学优势。相较于粒径更大、分布更不均一的乳剂，NLCs在相同植物黄油含量条件下更有效地促进HaCaT增殖与创面再填充，并降低TEWL，说明载体架构与纳米尺度组织方式是调节生物学表现的重要因素。其二，QT负载并未在基础培养条件下进一步增强增殖或创面再填充，但显著提高抗氧化防护，并在乳木果脂体系中改善局部皮肤滞留，因此其价值更多体现在氧化应激相关慢性创面环境中的红氧调节。研究还指出，乳木果脂NLC优于可可脂NLC，可能与其较高的不皂化组分及三萜、生育酚等内源性生物活性相关。文章同时审慎指出研究局限，包括未评估流变学性质、超声制备放大存在挑战，以及HaCaT单层和离体猪皮模型尚不能完全重建慢性创面中炎症、免疫失衡、血管生成障碍和生物膜等复杂病理环境。

研究结论部分可译为：
总之，本研究表明，植物黄油基NLCs能够被构建为稳定的纳米系统，其中乳木果脂基制剂在促进细胞增殖和体外创面再填充方面较可可脂基NLCs表现出更优越的生物学性能。乳木果脂基质的内在生物活性与纳米尺度组织共同支持了角质形成细胞增殖、创面再填充和皮肤屏障强化，而QT的结合则提供了氧化还原调节作用。与游离QT相比，乳木果脂NLCs中QT表现出更显著的皮肤渗入/局部滞留。综合来看，这些发现确定了NLCs-Sb-QT是一种有前景的局部给药候选制剂；其后续开发应优先关注长期理化稳定性，并在相关体内慢性创面模型中进一步评价，以验证其在慢性创面局部管理中的治疗潜力。