基因组整合的正交翻译系统在大肠杆菌中实现了功能性修饰的[NiFe]-氢化酶的生产

《Microbial Cell Factories》：Genomically integrated orthogonal translation system in Escherichia coli enables production of functional modified [NiFe]-hydrogenases

　　

利用正交翻译系统（OTSs）实现耐氧[NiFe]-氢化酶的功能多样化，为开发先进生物催化剂和生物杂化能源平台提供了有前景的策略。然而，基于质粒的OTSs常常施加代谢负担，并在发酵过程中遭受质粒不稳定性，特别是在与复杂金属酶共生产时。为克服这些生物工艺限制，研究人员采用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，将嗜冷吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/tRNA对整合到大肠杆菌BL21基因组中。所得菌株提供了一个无质粒的正交翻译背景，支持了琥珀抑制介导的Cupriavidus necator调控性[NiFe]-氢化酶（RH）的表达。利用该基因组整合的OTS，研究人员实现了全长、催化活性RH变体的生产。研究结果表明，染色体OTS与复杂金属酶的高效生产和成熟相容。本工作为氢化酶及相关杂化生物催化剂的生物正交工程奠定了基础。

**论文解读文章**

**研究背景、问题与研究目的**

耐氧型[NiFe]-氢化酶是一类金属酶，催化分子氢（H₂）与质子和电子的可逆转化，在H₂生产、生物燃料电池生物阳极及H₂驱动辅因子再生等生物技术应用中具有吸引力。然而，从天然或异源宿主中获得的活性氢化酶产量有限，严重制约了技术应用和基础研究。近期，研究团队在强健的大肠杆菌菌株中开发了异源生产氢化酶的生物工艺，以Cupriavidus necator（原名Ralstonia eutropha）的耐氧调控性[NiFe]-氢化酶（RH）为模型酶，使催化活性氢化酶产量相比天然生产提高130倍，证明了在大肠杆菌中高产量、短周期、良好可扩展性地生产活性氢化酶的可行性，大幅降低了生产成本。基于清洁燃料H₂的氢化酶电子供体能力激发了利用点击化学开发H₂驱动耦合化学-生物催化剂的兴趣。然而，为在杂化系统中有效利用这一催化能力，需要在酶与非天然氧化还原伙伴或电极表面之间进行精确连接。位点特异性引入可点击非天然氨基酸（ncAAs）为这种连接提供了独特的生物正交“锚点”。为实现此类位点特异性化学修饰，必须建立一个能够在体内将具有所需性质的ncAA引入氢化酶的生物系统。常用的方法是琥珀终止密码子抑制，即重新编程UAG终止密码子以编码ncAA，这依赖于一个由ncAA特异性氨酰-tRNA合成酶（aaRS）和抑制子tRNA组成的正交翻译系统（OTS）。这些OTS组分通常由质粒载体编码。新近开发的来自嗜冷古菌Methanococcoides burtonii的“冷适应性”吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（MburPylRS）显示出卓越的ncAA掺入效率和所需的底物混 promiscuity，与来自M. alaskense的工程化tRNA结合，可高效掺入S-烯丙基半胱氨酸（Sac），一种最小的可点击ncAA。然而，基于质粒的表达系统常面临显著挑战，如抗生素效应和质粒维持带来的高代谢负担，以及大规模培养中的质粒不稳定性。对于[NiFe]-氢化酶，遗传稳定性至关重要，因为其成熟过程异常复杂，需要协调共表达七个hyp基因用于辅因子组装。因此，稳定且安全的OTS组分整合到宿主基因组中具有显著需求。本研究旨在利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术，将嗜冷PylRS/tRNA对直接整合到大肠杆菌BL21 Gold的染色体中，该菌株已被验证为高产催化活性[NiFe]-氢化酶的稳健平台。通过将OTS嵌入宿主基因组，研究人员实现了全长生物正交修饰RH变体的成功生产，克服了质粒基OTS的瓶颈，为生物正交修饰氢化酶的生产提供了新视角。该论文发表在《Microbial Cell Factories》。

**关键技术方法**

研究人员采用CRISPR/Cas9辅助的无gRNA一步基因组编辑技术（CAGO），使用辅助质粒pCAGO（编码Cas9和λ-red重组系统），结合Golden Gate组装构建线性编辑供体盒。编辑盒包含左、右同源臂（针对SS3或lacZ位点）、氯霉素抗性基因（Cm^R）、通用N20PAM序列及嗜冷PylRS/tRNA基因。化学感受态细胞制备优化（OD₆₀₀≈1.0，37°C热激2分钟）用于转化编辑盒和pCAGO。通过两步重组：先λ-red介导的整合（Cm^R选择），再Cas9诱导双链断裂及第二次λ-red重组去除Cm^R，最终获得无标记基因组整合菌株。氢化酶生产使用EnPresso B培养基，在18°C下诱导表达，添加2 mM Sac进行ncAA掺入，通过Strep-Tactin亲和层析纯化RH变体，SDS-PAGE和免疫印迹分析蛋白，光谱法测定H₂氧化活性。

**研究结果**

**Selection of site-specific TAG mutation positions and construction of expression vectors for PylRS/tRNA pair in E. coli**
基于Boltz-2预测的HoxB结构，研究人员选择距远端[4Fe-4S]簇约4.5 ?的Asn223和约3.9 ?的Thr250作为ncAA掺入位点，两者溶剂可及表面积（SASA）均高于阈值，表明空间可及。通过定点突变将hoxB密码子替换为琥珀终止密码子，构建质粒pQF26 (N223*)和pQF27 (T250*)，并在其上插入编码嗜冷PylRS/tRNA的OTS基因，获得pQF28和pQF29。

**Bio-orthogonal labeling of the HoxB subunit of the C. necator RH via in-frame amber stop codon suppression**
（此部分为结果小节标题，实际内容包含在后续小节中）研究人员确认了Sac作为最小可点击ncAA用于掺入。

**Production of ncAA-labeled RH variants in plasmid-based OTS system**
将质粒基OTS（pQF28/29）与成熟质粒pQF18共转化至E. coli BL21 Gold，在含Sac培养基中培养。经Strep-Tactin纯化，未能获得全长RH变体，免疫分析显示仅为截短HoxB，表明质粒基OTS导致过早翻译终止，无法有效掺入ncAA。

**Selection of integration sites and generation of linear DNA editing cassettes**
选择lacZ基因和基因间区SS3作为整合位点，通过Cas-OFFinder确认选用N20序列无脱靶风险。Golden Gate组装成功获得线性编辑盒。

**Transformation of plasmid pCAGO for CRISPR/Cas9**
优化E. coli BL21 Gold化学感受态制备条件，发现OD₆₀₀为1.0–1.2时感受态最高，且pCAGO转化需37°C热激2分钟（42°C无效），尽管转化效率仍比K-12菌株低2–3个数量级，但足以获得重组菌落。

**Genome engineering**
将编辑盒转化至含pCAGO的BL21 Gold细胞。SS3位点整合获得6个阳性克隆（效率100%），而lacZ位点整合仅产生非特异性菌落，经菌落PCR确认非预期整合。选择SS3阳性克隆进行Cm^R基因去除。仅来自克隆k2和k6的菌株成功去除Cm^R，效率分别为55%和71%（55–71%），低于K-12菌株（75–100%）。最终获得无标记、无pCAGO的菌株BPylRS1。

**Functional evaluation of the genome-integrated OTS**
将pQF26/pQF27（编码RH变体）与pQF18（成熟基因）共转化至BPylRS1，获得菌株BPyl26RHN8和BPyl27RHT8。与质粒基OTS菌株相比，所有菌株生长相似，表明基因组整合无负面影响。通过Strep-Tactin层析，仅从BPylRS1背景中纯化出全长RH变体（含HoxB(N223Sac)和HoxB(T250Sac)），而质粒基OTS仅获得截短产物。免疫分析显示两种背景均存在大量截短HoxB（~55–60 mg L^?1），表明内源释放因子1（RF1）竞争依然存在。活性测定显示，仅RH(T250Sac)变体具有可检测的H₂氧化活性（~0.3 U mg^?1，约为天然RH的一半），而RH(N223Sac)无活性，表明Asn223对维持催化活性至关重要，Thr250则更耐受修饰。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，质粒基OTS因代谢负担和拷贝数不稳定，无法提供充足的ncAA-氨酰化tRNA，导致过早翻译终止和截短产物。而基因组整合OTS虽拷贝数较低，但提供了更稳定平衡的PylRS/tRNA组分表达，优化了氨酰化tRNA与RF1的比例，从而成功合成全长RH。然而，Sac标记RH的产量（~1.5 mg L^?1）远低于未标记天然RH（40 mg L^?1），这与RF1竞争有关，提出RF1敲除或多拷贝基因组整合（如CAST方法）可进一步改善。T250位点比N223更耐受修饰，仅RH(T250Sac)保持活性，而N223替换导致活性丧失，表明其结构重要性。该研究证明基因组整合OTS克服了质粒基系统的瓶颈，为复杂金属酶（如[NiFe]-氢化酶）的遗传密码扩展提供了稳健平台。

**研究结论**：在本研究中，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑，成功将嗜冷PylRS/tRNA系统整合到大肠杆菌BL21 Gold的基因组中，BL21 Gold是一个稳健且广泛用于高水平异源蛋白生产的平台。所得重组菌株E. coli BPylRS1实现了依赖琥珀抑制的RH变体生产，这些变体掺入了可点击ncAA Sac。与主要因过早翻译终止而产生截短产物的质粒基OTS相比，基因组整合的OTS支持了高效的UAG抑制和全长金属酶的成功纯化。这种差异直接证明基因组整合克服了传统质粒基翻译系统的瓶颈。通过在琥珀密码子下游放置Strep II标签，研究人员纯化了催化活性的RH，并规避了在稳健的BL21宿主中删除RF1的需求。至少对于氢化酶的生产而言，已证明OTS的染色体整合相较于质粒基OTS生产具有明显优势。然而，携带Sac的RH产量（~1.5 mg L^?1）低于未标记的天然RH（40 mg L^?1）。利用多个基因组整合（例如CAST方法）获得更高数量的OTS可能有助于ncAA掺入，从而获得更高的标记RH产量。尽管T250比N223更靠近远端[4Fe-4S]簇，但它更耐受修饰，因为只有RH(T250Sac)能以活性形式被纯化。进一步的改进，包括靶向RF1缺失和完整成熟基因簇的染色体整合，有望将该平台转化为一个稳健、有效的系统，用于具有定制功能的复杂金属酶的生物正交工程。