铜绿假单胞菌H16的巨质粒pHG1分隔系统中ParB结合区域的体外定位

《Annals of Microbiology》：In vitro localization of ParB-binding regions within the megaplasmid pHG1 partitioning system of Cupriavidus necator H16

　　

摘要

Cupriavidus necator H16是用于工业生物生产聚羟基烷酸酯（PHA）生物塑料的首选岩石自养菌株。然而，由于传统质粒需要持续使用抗生素进行筛选，其带来的经济和代谢负担阻碍了对该菌株的大规模基因工程改造。利用C. necator巨质粒pHG1中的天然主动分离系统ParABS，可提供一种无需筛选、有望实现稳定质粒维持的替代方案。虽然pHG1中的trans作用型马达蛋白parA和着丝粒结合蛋白parB已被鉴定，但关键的cis作用型着丝粒序列parS仍未被确定。在本研究中，我们通过生物信息学方法将pHG1操纵子归类为Ia型ParABS系统，并发现其与所分析的六种已知parS参考序列缺乏同源性，这种进化上的差异可能是为保持分离特异性、避免多部分基因组中的质粒不相容性所必需的。为功能定位着丝粒区域，我们开发了一种体外亲和层析检测方法，使用了固定的、N端带有六组组氨酸标签的重组ParB（H₆ParB）。该检测方法显示，在parAB操纵子下游约2.7 kb处存在一个PAR片段，这表明该区域存在主要的parS位点。此外，检测还发现，在上游约4.6 kb的ORI片段中可能存在一个低亲和力的ParB结合位点。尽管还需要进一步的体内验证和高分辨率测序来确定确切的回文序列，但分离出的连续PAR区域已经构成一个完整且独立的分离模块。这一定位为设计出无需筛选、适用于工业PHA生物生产的强大表达载体奠定了必要的生化基础。