家猫（Felis catus）成熟卵母细胞中TRPV3通道的表达与功能特性研究

《Biological Research》：Expression and functional characterization of the TRPV3 channel in domestic cat (Felis catus) mature oocytes

　　

摘要

背景

细胞内钙离子（Ca²⁺）信号传导对卵母细胞的成熟、激活以及受精过程至关重要，受精时产生的反复钙离子波动对于卵子激活和早期胚胎发育极为重要。小鼠卵母细胞表达多种非选择性阳离子通道来维持这些波动，其中包括瞬时受体电位（TRP）通道家族的成员TRPV3。除了调节钙离子外，TRPV3还能促进锌离子（Zn²⁺）的进入，而锌离子可影响皮质颗粒的分布以及肌动蛋白的结构。在哺乳动物中，皮质颗粒的外排机制能够防止多精入卵现象，而在小鼠卵母细胞中，通过药物激活TRPV3可引发足够的钙离子流入，从而促使卵子激活并实现孤雌生殖。尽管TRPV3在小鼠中具有如此重要的功能，但在其他哺乳动物中的表达与功能至今仍未被研究。本文旨在探讨猫卵母细胞中TRPV3通道的功能性表达情况。

方法

通过卵巢子宫切除术获取家猫的卵巢，然后分离出卵母细胞并在体外使其成熟。通过RT-PCR技术检测卵巢、生殖泡期卵母细胞以及减数第二次分裂中期卵母细胞中的Trpv3基因表达情况，同时利用免疫细胞化学方法确定TRPV3在卵母细胞膜上的定位。为验证抗体的特异性，还使用了野生型小鼠卵母细胞和TRPV3基因敲除小鼠卵母细胞作为对照。在加入TRPV3激动剂2-APB后，通过钙离子成像技术检测通道的功能活性。此外，还运用三维建模、分子对接技术以及对猫、小鼠和人类TRPV3蛋白的序列比较分析，重点研究2-APB结合位点以及通道形成区和温度感应区中相同或生化性质相似的氨基酸残基，以此判断不同物种间TRPV3功能可能存在的具体差异。

结果

我们在猫的卵巢以及生殖泡期和减数第二次分裂中期的卵母细胞中检测到了Trpv3基因转录本。免疫细胞化学实验也证实，猫卵母细胞膜上存在TRPV3蛋白，这一结果与之前关于小鼠卵母细胞的研究一致。此外，向猫的减数第二次分裂中期卵母细胞中加入2-APB后，细胞内的钙离子浓度显著上升，这证明了TRPV3通道具有功能性。通过比较分析发现，猫的TRPV3蛋白与小鼠和人类的TRPV3蛋白存在非保守性替换，尤其是在通道形成区、通道调控区和温度感应区，这些差异为解释不同物种间TRPV3功能的不同提供了分子层面的依据。

结论

我们的研究结果表明，家猫卵母细胞中确实存在功能性的TRPV3表达。与啮齿类动物和人类的TRPV3同源蛋白相比，猫的TRPV3具有独特的结构特征。这些发现为针对猫开发专门的人工卵子激活方案提供了理论支持，此类方案有望应用于濒危猫科动物的辅助生殖技术中。

背景

细胞内钙离子（Ca²⁺）信号传导对卵母细胞的成熟、激活以及受精过程至关重要，受精时产生的反复钙离子波动对于卵子激活和早期胚胎发育极为重要。小鼠卵母细胞表达多种非选择性阳离子通道来维持这些波动，其中包括瞬时受体电位（TRP）通道家族的成员TRPV3。除了调节钙离子外，TRPV3还能促进锌离子（Zn²⁺）的进入，而锌离子可影响皮质颗粒的分布以及肌动蛋白的结构。在哺乳动物中，皮质颗粒的外排机制能够防止多精入卵现象，而在小鼠卵母细胞中，通过药物激活TRPV3可引发足够的钙离子流入，从而促使卵子激活并实现孤雌生殖。尽管TRPV3在小鼠中具有如此重要的功能，但在其他哺乳动物中的表达与功能至今仍未被研究。本文旨在探讨猫卵母细胞中TRPV3通道的功能性表达情况。

方法

通过卵巢子宫切除术获取家猫的卵巢，然后分离出卵母细胞并在体外使其成熟。通过RT-PCR技术检测卵巢、生殖泡期卵母细胞以及减数第二次分裂中期卵母细胞中的Trpv3基因表达情况，同时利用免疫细胞化学方法确定TRPV3在卵母细胞膜上的定位。为验证抗体的特异性，还使用了野生型小鼠卵母细胞和TRPV3基因敲除小鼠卵母细胞作为对照。在加入TRPV3激动剂2-APB后，通过钙离子成像技术检测通道的功能活性。此外，还运用三维建模、分子对接技术以及对猫、小鼠和人类TRPV3蛋白的序列比较分析，重点研究2-APB结合位点以及通道形成区和温度感应区中相同或生化性质相似的氨基酸残基，以此判断不同物种间TRPV3功能可能存在的具体差异。

结果

我们在猫的卵巢以及生殖泡期和减数第二次分裂中期卵母细胞中检测到了Trpv3基因转录本。免疫细胞化学实验也证实，猫卵母细胞膜上存在TRPV3蛋白，这一结果与之前关于小鼠卵母细胞的研究一致。此外，向猫的减数第二次分裂中期卵母细胞中加入2-APB后，细胞内的钙离子浓度显著上升，这证明了TRPV3通道具有功能性。通过比较分析发现，猫的TRPV3蛋白与小鼠和人类的TRPV3蛋白存在非保守性替换，尤其是在通道形成区、通道调控区和温度感应区，这些差异为解释不同物种间TRPV3功能的不同提供了分子层面的依据。

结论

我们的研究结果表明，家猫卵母细胞中确实存在功能性的TRPV3表达。与啮齿类动物和人类的TRPV3同源蛋白相比，猫的TRPV3具有独特的结构特征。这些发现为针对猫开发专门的人工卵子激活方案提供了理论支持，此类方案有望应用于濒危猫科动物的辅助生殖技术中。