多组学分析鉴定冈比亚按蚊复合体（Anopheles gambiae species complex）姐妹种间拟除虫菊酯抗性关联位点

《BMC Genomics》：Multi-omics analysis identifies loci associated with pyrethroid resistance across sister species in the Anopheles gambiae species complex

　　

背景：冈比亚按蚊复合体（Anopheles gambiae species complex）约含九个姊妹种，包括An. gambiae、An. coluzzii和An. arabiensis，为非洲四种主要疟疾媒介中的三种。基于杀虫剂的媒介控制仍是抗击疟疾最关键的工具，高度依赖拟除虫菊酯类（pyrethroid）杀虫剂，但广泛传播的拟除虫菊酯抗性危及这些方法的有效性。目前可用于追踪流行区拟除虫菊酯抗性的诊断标记有限，主要集中在杀虫剂靶标位点的突变。结果：研究人员对西非七个杀虫剂抗性种群进行遗传分析，揭示An. gambiae、An. coluzzii和An. arabiensis姐妹种间共享的拟除虫菊酯抗性关联位点，包括kdr（knockdown resistance）、GSTE1?8及CYP6P区域。值得注意的是，电压门控钠通道（voltage?gated sodium channel, VGSC）中此前在An. coluzzii和An. gambiae中鉴定的I1527T突变，在本研究于布基纳法索野外采集的An. arabiensis中被检出。此外，An. coluzzii与An. arabiensis共有的GSTE7中L207I突变显著提高了对溴氰菊酯（deltamethrin）的存活率。通过整合RNA?seq数据与按蚊千人基因组项目（Anopheles gambiae 1000 Genomes Project, Ag1000G）数据，研究人员鉴定出与主要杀虫剂抗性相关转录本（如CYP6P3、CYP9K1和CYP6AA1）表达相关的推定eQTL（expression Quantitative Trait Loci）。结论：本研究揭示了数个可在流行区实施的潜在抗性诊断标记，并鉴定出布基纳法索地区An. arabiensis与An. coluzzii之间的推定基因渗入。

《BMC Genomics》刊载的这篇论文以西非布基纳法索及科特迪瓦采集的冈比亚按蚊复合体（Anopheles gambiae species complex，含姊妹种An. gambiae、An. coluzzii及An. arabiensis）杀虫剂抗性实验室定型品系及野外种群为对象，通过全基因组测序（WGS）、池化RNA?seq及与Ag1000G（Anopheles gambiae 1000 Genomes Project）数据整合的多组学分析，鉴定跨物种共享的拟除虫菊酯（pyrethroid）抗性位点、推定基因渗入（introgression）区间及推定顺式eQTL（cis?expression Quantitative Trait Loci），并功能性验证新发现的非同义突变与抗性表型的关联，旨在弥补现有流行区拟除虫菊酯抗性分子诊断标记匮乏及跨物种抗性机制比较研究的不足。

主要关键技术方法

研究人员对来自布基纳法索（含野外采集An. coluzzii Tengrela(F)种群）及科特迪瓦的7个定型抗性品系（An. gambiae Bakaridjan、An. coluzzii Banfora/Tiefora/VK7、An. gambiae s.l. Tiassalé、An. arabiensis Gaoua）与已知敏感/抗性Banfora亚品系共157个个体进行Illumina WGS；对其中7个品系及新测Tiassalé_Ag.sl进行pooled RNA?seq；采用GATK流程进行变异检测与过滤、Beagle分阶段、plink2进行PCA与群体结构（ADMIXTURE）分析；用selscan计算iHS与iHH12（H12）选择性清除信号；用ABBABABAwindows.py计算|fdM|与F_ST鉴定基因渗入；用MatrixEQTL进行模拟个体读计数的伪eQTL分析并与Ag1000G选择清除峰交叉过滤；WHO管试法结合等位基因特异性PCR及TaqMan LNA探针验证kdr I1527T与GSTE7 L207I与deltamethrin存活率的关联；dsRNA显微注射敲降TEP1后检测对deltamethrin敏感性的影响。

研究结果

Variant calling（变异检出）

对157个高质量样本共检出12,389,338个高质量变异，其中9,615,152个为双等位SNP；SNPEff预测高影响SNP涉及化学感觉蛋白（chemosensory protein, CSP）簇与代谢酶CYP6Z4终止密码子获得。3个意外分组样本被剔除，各品系按预期分组。

Population structure（群体结构）

基于3L染色体的系统发育树与SplitsTree显示布基纳法索种群呈((An. gambiae, An. arabiensis), An. coluzzii)关系且有种间连通迹象；ADMIXTURE分析（k=7）显示一个An. arabiensis个体与An. coluzzii Tiefora品系有共同祖源成分，野外An. coluzzii Tengrela(F)具混合祖源。

Inversion status（倒位状态）

2La在除Tiassalé_Ag.sl外几近固定；2Rb高频见于Bakaridjan_Ag与Gaoua_Aa；2Rc中间频见于Tengrela(F)与Tiefora；2Ru高频见于Tiefora，中间频见于Tengrela(F)、Banfora与VK7。

Selective sweeps（选择清除）

野外Tengrela(F)种群在kdr、CYP9K1、GSTE簇及CYP6P簇区域显示延伸单倍型纯合性（iHS与H12 top 1%重叠），GSTE区H12峰对应GSTE2 I114T，CYP9K1峰对应同义SNP；实验室品系在Keap1与GSTD区见选择信号，无kdr区清除。

Shared haplotypes（共享单倍型）

ABBA?BABA |fdM| top 5%且F_STbottom 5%重叠区富集角质层结构组分的GO条目，含CYP9K1、CYP6P区、CYP4G16、CSP簇、Rdl（resistance to dieldrin）及kdr与GSTE1?8区；kdr与GSTE区|fdM|达top 5%，单倍型聚类显示An. arabiensis与An. coluzzii在kdr（I1527T单倍型）及GSTE区共享单倍型，提示推定种间基因渗入。

Kdr locus（kdr位点）

WGS与TaqMan证实V402L?I1527T（原仅报道于An. coluzzii/An. gambiae）存在于Gaoua_Aa品系（低频<5%跨多世代）及布基纳法索2021?2022年野外An. arabiensis（Tiefora与Ouagadougou各2例）。An. arabiensis中新发现A1553T非同义突变（频率45%）。

GSTE loci（GSTE位点）

GSTE1(GSTE1?8簇)与GSTE7中各发现两个非同义SNP（L37F/E83D与P3R/L207I）在An. coluzzii与An. arabiensis间共享；WHO管试显示An. coluzzii Tiefora品系中GSTE7 L207I杂合子与5×诊断剂量deltamethrin存活率显著相关（Fisher's Exact Test, P<0.0001），An. gambiae s.l. Tiassalé呈边缘显著（P=0.0571），对氯菊酯与α?氯氰菊酯无显著关联。

TEP1 locus（TEP1位点）

Tengrela(F)见TEP1选择清除；dsTEP1敲降后deltamethrin暴露死亡率与对照无差异，表明TEP1选择清除由疟原虫感染免疫压力驱动而非杀虫剂抗性。

Copy number variation（拷贝数变异，CNV）

各品系检出已知抗性相关CNV：An. gambiae Bakaridjan有CYP9K1 dup；An. arabiensis Gaoua_Aa有GSTE1/GSTE2 dup、TEP1与CYP6Z4 dup；An. coluzzii Tengrela(F)/Tiefora/VK7有CYP6AA1/AA2 dup（Cyp6aap_Dup系列）、TEP1 dup及低复杂度角质层蛋白（CPLC）簇dup等。

eQTL identification（eQTL鉴定）

模拟pooled RNA?seq的eQTL分析筛得与343个已知抗性候选基因中304个关联的41,920个SNP，经Ag1000G Burkina Faso种群H12 top 5%过滤后保留1,008个eQTL?相关SNP（771个An. coluzzii、621个An. gambiae、384个共有），主要关联CYP6P3、CYP6P4、CYP6AA1、CYP9K1及UGT（AGAP006222、AGAP007029）表达；CYP6P3/AA1/AA2衍生等位基因与抗性品系高表达相关，SusBanfora与ResBanfora品系CYP6AA1/AA2基因型频率差异印证其与抗性表型关联。kdr与GSTE簇未见顺式eQTL，符合其功能由非同义突变驱动。

讨论与结论总结

研究人员指出定型品系可外推至野外条件，西非An. gambiae complex姊妹种间存在杀虫剂抗性相关位点（含kdr I1527T单倍型及GSTE1?GSTE7连锁非同义突变L207I等）的推定适应性基因渗入，其中GSTE7 L207I杂合子显著增强deltamethrin存活。TEP1选择清除归因其抗疟原虫免疫作用。整合WGS与转录组鉴定的推定eQTL锚定于CYP6与CYP9K1等代谢抗性基因选择清除区，可作潜在追踪标记。研究强调多孔的种间边界促进适应性等位基因流，突显将基因组监测整合入媒介控制规划以预判并缓解抗性等位基因扩散的重要性，实验室品系保留的高遗传多样性对基因驱动策略评估具参考意义。

结论：本研究揭示数个可在流行区实施的潜在拟除虫菊酯抗性诊断标记，并鉴定出布基纳法索An. arabiensis与An. coluzzii间的推定基因渗入。