基于肽功能化纳米颗粒的食源性致病菌去除与分析

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Removal and analysis of foodborne-associated pathogens via peptide functionalized nanoparticles

　　

食源性疾病仍是主要公共卫生问题，世界卫生组织（WHO)于2010年报告全球约有6亿例疾病和42万例死亡，其中多数由空肠弯曲菌(Campylobacter spp.)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、大肠杆菌(Escherichia coli)及单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)等病原体引起。由于鲜肉和乳制品保质期较短，对污染食品中病原体的快速检测至关重要。传统微生物食品分析的参比方法需要耗时的非选择性及选择性培养程序，因此亟需更高效的检测方法。在本研究中，研究人员采用超顺磁氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPIONs)，其表面功能化修饰了源自唾液蛋白GP-340的肽段KRQGRVEVLYRASWGTV，成功从不同纯培养基和零售肉制品匀浆中去除多种食源性微生物，包括假洋葱伯克霍尔德菌(Pseudomonas paracarnis)、空肠弯曲菌(C. jejuni)、大肠杆菌(E. coli)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、肠道沙门氏菌(S. enterica)和单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)。研究发现不同菌株的提取效率存在差异，纯培养 Nbsp;培养时提取效率从18%(C. jejuni)到完全提取(E. faecalis、L. monocytogenes和P. paracarnis)不等。研究还表明，L. monocytogenes能够从高倍数非致病性P. paracarnis共存培养体系以及复杂食品基质中成功去除。

食源性疾病持续构成全球性公共卫生挑战，世界卫生组织2010年数据显示，全球每年约600 million人罹患食源性疾病，其中约420,000例死亡，涉及31种食源性危害因素，主要由空肠弯曲菌(Campylobacter spp.)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)及大肠杆菌(Escherichia coli)等病原体引发。单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)同样可导致严重食源性疾病——人李斯特菌病(listeriosis)，临床表型涵盖亚临床型胃肠炎至侵袭性疾病，主要包括三种形式：（i）妊娠相关及新生儿李斯特菌病、（ii）菌血症或败血症型李斯特菌病、及（iii）中枢神经系统(central nervous system, CNS)感染。鉴于鲜肉与乳制品等短保质期产品的特性，快速检测污染食品中的病原体以保障食品质量与 consumer safety 具有重要现实意义。然而，传统培养方法需经非选择性与选择性增菌及后续确认步骤，耗时较长。

为满足快速检测需求，研究人员等探索了多种高性能方法，包括免疫学技术、分子生物学技术、测序技术、基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF)及光谱学方法等。超顺磁氧化铁纳米颗粒(SPIONs)已在磁靶向药物递送、磁热疗、磁粒子光谱(magnetic particle spectroscopy)及T细胞负载等领域展现广泛的应用前景。既往研究已成功将肽功能化SPIONs应用于血流感染的诊断，通过靶向病原体实现快速检测。用于上述研究的纳米颗粒可从培养基和血液中有效提取脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid, LTA)及病原体，若结合偏移临界磁粒子光谱(critical offset magnetic particle spectroscopy, COMPASS)等附加检测手段，该技术可在保持灵敏度的同时实现比标准培养方法更快速的样品制备与分析。所用肽段源自天然唾液蛋白GP-340，亦称恶性脑肿瘤缺失蛋白1(Deleted in Malignant Brain Tumors 1, DMBT1)，该蛋白以其细菌结合特性而著称，此特性归因于其清道夫受体富含半胱氨酸(scavenger receptor cysteine-rich, SRCR)结构域，尤其是VEVLXXXXW结合基序。基于上述认识，研究人员等提出将类似原理应用于食品安全领域的病原体识别。

该研究采用表面结合肽段KRQGRVEVLYRASWGTV的柠檬酸包被SPIONs，通过磁分离方式去除纯培养、共培养以及肉涂抹酱和绞肉等食品基质中的食源性微生物，包括假洋葱伯克霍尔德菌(Pseudomonas paracarnis)、空肠弯曲菌(C. jejuni)、大肠杆菌(E. coli)、粪肠球菌(E. faecalis)、肠道沙门氏菌(S. enterica)和单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)。

研究所用的主要关键技术方法包括：柠檬酸包被超顺磁氧化铁纳米颗粒(SPIONCit)的共沉淀法合成及肽段修饰（通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)化学方法将肽段共价结合于纳米颗粒表面）；微波等离子体原子发射光谱法(microwave plasma atomic emission spectroscopy, MP-AES)测定铁含量；动态光散射(dynamic light scattering, DLS)纳米粒度仪分析粒径及多分散指数(polydispersity index, PDI)；高效液相色谱(high pressure liquid chromatography, HPLC)-紫外检测法监测肽段结合效率及稳定性；磁分离提取法（基于已建立的提取流程，在旋转混合后利用磁力架分离纳米颗粒-细菌复合物）；螺旋平板计数法结合自动菌落计数设备活菌计数；共培养体系验证（应用非致病性P. paracarnis作为背景菌群代表，按10:10⁶、100:10⁶、1000:10⁶ CFU/ml比例制备L. monocytogenes共培养）；食品基质处理（依据国际标准DIN EN ISO 6887–2:2017制备肉基质匀浆，来源为德国巴伐利亚州当地超市零售鲜肉产品）及选择性培养基平板计数；以及三维共聚焦激光扫描显微镜(three-dimensional confocal laser scanning microscopy, 3D CLSM)成像技术（采用无标记共聚焦反射显微术(confocal reflectance microscopy, CRM)结合荧光细胞膜染色，对纳米颗粒-细菌复合物进行三维重构和定位分析）。

主要研究结果如下：

**SPIONCit的合成及后续肽段功能化**

研究人员采用改良共沉淀法合成SPIONCit，并通过EDC/Sulfo-NHS化学将GP-340衍生肽段KRQGRVEVLYRASWGTV共价结合于其表面。所用SPIONCit的水合动力学直径(z-average)为56±7 nm，PDI为0.219±0.008。肽段结合后，纳米颗粒形成更大团聚体，z-average增至500±66 nm，PDI显著升高至0.728±0.167。HPLC-UV分析证实肽段成功结合且未从纳米颗粒表面洗脱。

**不同病原体从纯培养和共培养中的提取**

SPIONPep对各类细菌的纯培养提取效率存在显著差异。空肠弯曲菌(C. jejuni)提取效率最低（10³ CFU/ml时为18%，10⁴ CFU/ml时为26%），而粪肠球菌(E. faecalis)和单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)可实现近乎完全的提取（E. faecalis在10³和10⁴ CFU/ml时分别为134%和121%；L. monocytogenes在10³ CFU/ml时为103%，10⁴ CFU/ml时为78%）。总体而言，革兰氏阳性菌提取效率高于革兰氏阴性菌，但假洋葱伯克霍尔德菌(Pseudomonas paracarnis)作为革兰氏阴性菌例外，在10³和10⁴ CFU/ml时均达到80%的提取效率。其他革兰氏阴性菌如肠道沙门氏菌(S. enterica)（37%和42%）和大肠杆菌(E. coli)（54%和63%）亦可从纯培养中部分提取。Mann-Whitney U检验验证提取程序有效性，各菌株对照与（颗粒+上清）组间均无显著差异（所有q>0.05）。

共培养实验中，L. monocytogenes在非致病性P. paracarnis高丰度背景（10⁶ CFU/ml）下仍可有效提取：10/10⁶ CFU/ml时效率为42%，100/10⁶ CFU/ml时为35%，1000/10⁶ CFU/ml时为31%，表明SPIONPep在复杂菌群背景下对目标病原体仍具选择性结合能力。

**从食品基质中提取L. monocytogenes**

在肉涂抹酱基质中，L. monocytogenes提取效率随接种浓度增加而升高：10 CFU/ml时为7%，100 CFU/ml时为23%，1000 CFU/ml时为31%，10000 CFU/ml时达最高35%。然而，绞肉基质中提取效率显著降低：10和100 CFU/ml时均仅1%，1000 CFU/ml时3%，10000 CFU/ml时2%，提示食品基质理化性质对提取效率具有重要影响。

**三维共聚焦激光扫描显微镜分析**

通过CRM结合荧光染色P. paracarnis的三维成像，直观证实了SPIONPep-细菌复合物的形成。多个z-stack序列显示纳米颗粒集中于单个P. paracarnis细胞周围，稀疏颗粒簇的高分辨图像揭示了单个纳米颗粒的细节信息，强度轮廓测量显示单颗粒半高全宽(full width half maximum, FWHM)约为181 nm。

**讨论总结**

肽功能化SPIONs为食品中病原体的检测提供了可靠方法，但仍需针对部分病原体的提取效率进行优化。该方法应进一步研究并与后续鉴定工具如qPCR或COMPASS联用，以实现更快速的检测分析。研究中的关键发现包括：首先，纳米颗粒功能化成功且肽段结合稳定，HPLC-UV验证了结合效率及抗洗脱性。其次，革兰氏阳性菌提取效率整体优于革兰氏阴性菌，但P. paracarnis作为例外表现突出。空肠弯曲菌的低提取效率可能与其独特的脂寡糖(lipooligosaccharides, LOS)结构（缺乏O抗原）及螺旋形态、运动能力有关。E. faecalis效率超过100%可能源于其球菌链状/簇状生长特性及操作过程中的机械断裂。第三，共培养体系中L. monocytogenes提取效率降低，可能与P. paracarnis竞争结合位点、洗涤步骤中竞争脱落、以及高菌量导致的纳米颗粒聚集行为改变有关。第四，食品基质显著降低提取效率，肉涂抹酱（7–35%）优于绞肉（1–3%），这可能归因于不同基质中蛋白质、糖类和脂肪含量的差异，这些组分可能通过结合肽段影响钙依赖性VEVLXXXXW基序与 poly-sulfated/poly-phosphated 配基的相互作用，或通过影响钙离子可用性干扰结合机制。最后，CLSM直观证实了纳米颗粒与细菌的稳定结合，尽管光学衍射限制导致实测信号反映的是散射对象的光学范围而非真实的物理或水合动力学尺寸。

**研究结论**

肽功能化SPIONs有望成为一种可靠的病原体检测方法，不仅适用于纯培养体系，也可应用于食品样品，尽管部分病原体的提取效率仍需进一步优化。该诊断程序值得进一步深入研究，并应与后续鉴定工具如qPCR或临界偏移磁粒子光谱(COMPASS)联用以获得更快速的检测分析结果。