PRMT5抑制促进跨物种精原细胞扩增并抑制分化

《Cell Regeneration》：PRMT5 inhibition promotes cross-species spermatogonia expansion and suppresses differentiation

　　

精原干细胞（SSCs）在治疗男性不育方面具有巨大潜力，但其临床转化因缺乏维持体外未分化状态的最优条件而受阻。在这项研究中，研究人员聚焦于在分化过程中上调的表观遗传调控因子，将其作为潜在靶点。通过靶向此类保守调控因子的一个小分子筛选，研究人员发现PRMT5抑制在体外GDNF（胶质细胞源性神经营养因子）缺乏、易分化的微环境中，抑制了小鼠SSC分化并增强了其增殖。通过SSC移植实验，研究人员证实经EPZ015666处理的SSC保留了其精原细胞身份。这种分化抑制效应在撤除EPZ015666后是可逆的，从而允许恢复正常的精子发生。值得注意的是，EPZ015666在体外也抑制了人类和非人灵长类精原细胞的分化并促进了其增殖。从机制上讲，EPZ015666通过抑制PRMT5的酶活性位点来发挥此效应。这些发现表明，PRMT5抑制可能为体外培养人类SSC提供一种新策略。

**论文解读：靶向PRMT5抑制精原细胞分化，开辟跨物种精原干细胞体外扩增新策略**

**研究背景与问题**

男性不育影响全球超过1亿男性，精原干细胞（SSCs）因其自我更新和分化潜能，成为细胞疗法治疗男性不育（如化疗后青春期前男孩的生育力恢复）的候选细胞。然而，实现人类SSCs的长期体外扩增面临重大技术障碍。尽管小鼠SSCs的长期培养和移植方法已成熟，但维持和扩增人类SSCs的最优条件尚不明确。现有研究依赖于细胞因子（如GDNF）的体外培养范式，未能成功实现人类SSCs的长期培养。研究表明，SSC分化并非被动过程，而是由特定分子通路（如视黄酸信号）驱动的主动过程。因此，主动抑制分化上调的机制可能是维持体外未分化状态的关键策略。表观遗传调控因子在细胞命运决定中起核心作用，但靶向这些因子以建立稳定的人类SSC培养体系尚未被充分探索。

**研究内容与结论**

本研究通过分析人类、猕猴和小鼠的单细胞转录组，发现从未分化精原细胞（SPG）向分化精原细胞转变过程中，多种表观遗传修饰因子（如DNMT1、EHMT2、EZH2、PRMT3、PRMT5）表达上调。研究人员假设这些上调的表观遗传调控因子是精原细胞分化所必需的，并由此开展了一项小分子筛选，以寻找能抑制分化的化合物。筛选发现，蛋白精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）抑制剂EPZ015666（简称EPZ）在体外能在缺乏GDNF的分化倾向性微环境中，显著抑制小鼠SSC分化并促进其增殖。通过SSC移植实验，证实经EPZ处理的小鼠SSCs保留了精原细胞身份，并能在体内恢复精子发生，最终产生功能性精子，且由此产生的后代具有生育能力。机制研究表明，EPZ通过抑制PRMT5的酶活性位点发挥作用，而PRMT5的甲基转移酶活性是促进精原细胞分化的关键。更重要的是，EPZ在体外同样能抑制人类和非人灵长类（猕猴）精原细胞的分化，并维持其未分化状态。该研究为建立人类SSCs体外培养体系提供了新策略，相关成果发表在《Cell Regeneration》。

**主要技术方法**

1. **单细胞转录组分析**：整合人类、猕猴（GSE142585）和小鼠睾丸（GSE112393）的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，进行跨物种比较分析，鉴定与精原细胞分化相关的保守表观遗传调控因子。
2. **小分子化合物筛选**：在GDNF缺乏的诱导分化条件下，使用包含多种表观遗传修饰因子抑制剂的小分子文库（10 μM），对培养的小鼠SSCs进行筛选，以克隆形成数量为指标评估化合物效果。
3. **SSC移植实验**：将经EPZ处理并培养10代的小鼠SSCs（GFP标记）移植到白消安处理导致不育的受体小鼠生精小管中，评估其体内定植、分化及产生功能性精子的能力。
4. **CRISPR-Cas13d介导的基因敲低与PRMT5敲除/回补实验**：通过CRISPR-Cas13d系统敲低小鼠SSCs中的Prmt5，验证表型；利用Prmt5^flox/flox; Rosa26-CreERT²小鼠的SSCs，结合4-羟基他莫昔芬（4OHT）诱导PRMT5敲除，并通过回补野生型（WT）或催化失活突变体（E444Q）的PRMT5，证实其酶活性在分化中的作用。
5. **人类及非人灵长类精原细胞培养**：从人类（梗阻性无精症患者）和猕猴睾丸活检样本中，通过磁激活细胞分选（MACS）富集ITGA6⁺细胞进行体外培养，评估EPZ对精原细胞维持和分化的影响。

**研究结果**

**A screen identifies the PRMT5 inhibitor EPZ for mouse SSC maintenance**
通过分析单细胞转录组，发现分化中精原细胞（SPG3-5）的表观遗传修饰因子基因评分高于未分化精原细胞（SPG1-2）。以此为基础，研究人员进行了小分子筛选，鉴定出PRMT5抑制剂EPZ015666能最有效地促进小鼠SSC克隆形成。

**EPZ treatment promotes spermatogonia expansion while suppressing their differentiation**
免疫荧光分析显示，与阴性对照组相比，EPZ处理组中ID4⁺KI67⁺（增殖的未分化SSC标志）细胞比例显著升高，而DDX4⁺DMRT1⁺（分化精原细胞标志）细胞比例显著降低。在连续传代培养中，EPZ组维持了PLZF（未分化精原细胞标志）的表达，并表现出更大的克隆大小和更高的克隆数量。

**The inhibition of spermatogonial differentiation by EPZ is reversible**
在小鼠睾丸组织培养模型中，EPZ处理增加了ID4⁺SSC的比例，减少了STRA8⁺早期精母细胞的比例。撤除EPZ后，这些效应发生逆转，表明EPZ对分化的抑制作用是可逆的。

**Mouse SSCs expanded through EPZ treatment retain functional competence**
经过10代EPZ培养的小鼠SSCs移植到不育小鼠睾丸后，能成功定植并生成包含PLZF⁺未分化精原细胞、SYCP3⁺γH2AX⁺精母细胞和DDX4⁺PNA⁺精子细胞的各级生精细胞。通过胞浆内精子注射（ROSI），获得了可育后代。

**EPZ maintains undifferentiated SPG numbers under spermatogenesis-defective conditions**
在白消安诱导的化疗损伤模型中，EPZ处理能维持或增加PLZF⁺未分化精原细胞的数量，无论是在损伤后再生阶段还是与化疗药物同时使用。

**PRMT5 promotes spermatogonial differentiation via its enzymatic activity**
通过CRISPR-Cas13d敲低Prmt5，重现了EPZ处理的效果，包括促进增殖和下调分化相关基因（如Dmrt1）。在PRMT5敲除的SSCs中，回补野生型PRMT5能恢复DMRT1表达，而回补催化失活突变体（E444Q）则不能。RNA测序分析进一步证实PRMT5（E444Q）组下调了分化相关基因，WGCNA分析显示负相关模块富集于减数分裂纺锤体相关通路。

**EPZ maintains undifferentiated SPG and suppresses their differentiation in monkeys and humans**
在猕猴和人类精原细胞体外培养中，EPZ处理均能显著增加UTF1⁺或UCHL1⁺未分化精原细胞的数量，同时减少DMRT1⁺分化精原细胞的数量。在人类睾丸组织培养中，EPZ同样维持了UTF1⁺未分化精原细胞的比例。

**总结与讨论**

本研究鉴定出在精原细胞分化过程中上调的表观遗传调控因子，并发现靶向这些因子的小分子抑制剂，特别是PRMT5抑制剂EPZ，能够有效抑制分化并促进扩增。研究结果表明，靶向抑制分化上调的表观遗传因子是一种有前景的体外维持未分化精原细胞的新培养策略。EPZ在小鼠、猴和人中表现出的保守效应，提示其可能通过抑制精原细胞在体外培养中固有的分化倾向，来维持其未分化状态。重要的是，EPZ处理不损害SSC的固有身份和功能，包括移植后的定植能力和精子发生潜力，这为潜在的临床应用提供了基础。机制上，EPZ通过抑制PRMT5的甲基转移酶活性发挥作用，但PRMT5调控分化的具体分子机制仍需进一步阐明。

**研究结论**
这些发现表明，PRMT5抑制可能为体外培养人类SSC提供一种新策略。