中国江西省健康和患病家禽中分离的携带mcr-1基因大肠杆菌的分子流行病学及致病潜力分析

《Frontiers in Microbiology》：Molecular epidemiology and pathogenic potential of mcr-1-positive Escherichia coli isolated from healthy and diseased poultry in Jiangxi, China

　　

引言：可移动粘菌素耐药基因（mcr）的出现和传播已引起全球公共卫生关注，家禽是其主要储存库。然而，对于作为中国南方重要家禽生产基地的江西省，携带mcr-1基因的大肠杆菌的系统性调查仍然有限。方法：2020年至2024年间，从江西省11个城市的患病（n = 291）和健康（n = 300）家禽中收集了591株大肠杆菌菌株。通过菌落聚合酶链式反应（PCR）鉴定携带mcr-1基因的菌株。测定了16种抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）。进行了全基因组测序和生物信息学分析。使用大蜡螟感染模型评估致病性。结果：在591株菌株中，24株携带mcr-1基因，包括15株来自患病家禽的禽致病性大肠杆菌（APEC）菌株和9株来自健康家禽的肠道大肠杆菌菌株。所有24株分离株均表现出粘菌素耐药性和100%的多药耐药（MDR）。观察到对安普霉素（AP）（100%）、磺胺异噁唑（SIZ）（100%）、氨苄西林（AMP）（95.83%）、头孢噻呋（FUR）（95.83%）、四环素（TET）（95.83%）和复方新诺明（SMZ-TMP）（95.83%）的高耐药率，而所有分离株对美罗培南（MRP）仍保持敏感。基因组分析鉴定出多种获得性耐药基因，包括tet(A)、bla_CTX-M、sul2和floR，与表型耐药谱一致。mcr-1基因主要位于IncI2质粒上，在8株APEC分离株中检测到染色体整合。毒力基因型分析显示关键APEC相关基因（iss、ompT、hlyF、iroN、iutA）的高流行率，而iucD和papG在所有分离株中均缺失。感染试验表明大多数分离株具有强致死性，一些来自健康家禽的肠道大肠杆菌也表现出高死亡率。讨论：质粒携带和染色体整合的mcr-1基因在基因组中共存，提示了具有潜在传播性的双重维持机制。来自健康家禽的肠道大肠杆菌携带更高的耐药基因负荷和毒力潜力，揭示了一个隐藏的储存库。这些发现表明需要扩大监测、谨慎使用抗菌药物以及进行功能验证，以进一步评估其对动物和公共卫生的潜在双重威胁。

**研究背景与意义**
粘菌素作为治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的最后一道防线，其耐药基因mcr的出现和全球传播引发了严重的公共卫生关切。其中，mcr-1基因最为流行，已在全球范围内的人、动物和环境来源的大肠杆菌中检出。家禽被认为是携带mcr-1大肠杆菌的主要储存库，并通过食物链向人类传播。禽致病性大肠杆菌（APEC）是引起家禽大肠杆菌病的主要病原体，可导致气囊炎、心包炎和肝周炎等全身性感染，造成重大经济损失。APEC菌株常表现出多药耐药（MDR），严重影响了临床治疗和疾病控制。相比之下，健康家禽肠道内定植的肠道大肠杆菌虽不引起临床疾病，却是抗菌药物耐药（AMR）基因的重要储存库，这些基因可能转移至致病菌株或直接传播给人类，构成通过食物链、直接接触和环境污染传播的隐蔽威胁。因此，阐明家禽来源携带mcr-1大肠杆菌的基因组和表型特征，对于评估与商业家禽生产相关的公共卫生风险至关重要。

江西省是中国南方重要的家禽生产基地，养殖规模大、饲养密度高。然而，该地区携带mcr-1大肠杆菌的流行情况和分子特征尚未完全阐明。本研究旨在调查2020年至2024年间江西省11个城市患病和健康家禽中携带mcr-1大肠杆菌的流行情况，并表征这些分离株的分子特征、AMR谱、毒力基因库和致病潜力。研究结果将为当地家禽中携带mcr-1大肠杆菌的防控、抗菌药物的合理使用以及公共卫生风险的缓解提供基线流行病学数据和参考。本论文发表在《Frontiers in Microbiology》期刊上。

**主要技术方法**
研究人员于2020年至2024年从江西省11个城市的家禽中收集了291株来自患病家禽病变组织的APEC和300株来自健康家禽粪便的肠道大肠杆菌。通过菌落PCR检测mcr-1基因。使用商品化MIC测试板测定16种抗菌药物的最低抑菌浓度。对阳性菌株进行全基因组测序，利用生物信息学平台进行序列分型、耐药基因、毒力基因及基因组定位分析。采用大蜡螟幼虫感染模型评估菌株的致病性。

**研究结果**
**携带mcr-1基因菌株的流行情况**
在591株大肠杆菌中，共鉴定出24株携带mcr-1基因，总检出率为4.06%。其中15株来自患病家禽组（5.15%），被鉴定为APEC；其余9株阳性菌株分离自健康家禽粪便（3.00%）。

**抗菌药物敏感性谱**
所有24株菌株均对粘菌素（CST）耐药。对安普霉素（AP）和磺胺异噁唑（SIZ）的耐药率为100.00%，对氨苄西林（AMP）、头孢噻呋（FUR）、四环素（TET）和复方新诺明（SMZ-TMP）的耐药率均为95.83%。所有菌株对美罗培南（MRP）均敏感。所有24株菌株均表现出多药耐药（MDR）。

**系统发育分析**
基于核心基因构建的系统发育树显示了三个主要分支。第一分支（红色）仅包含肠道大肠杆菌分离株，表明它们之间亲缘关系密切。第二分支（绿色）包含一株肠道大肠杆菌和三株APEC。最大的第三分支（紫色）包含大多数分离株，包括肠道大肠杆菌和APEC菌株，显示出高度的遗传多样性。未观察到严格的来源特异性聚类，表明部分菌株共享共同的遗传谱系，与其来源无关。

**携带mcr-1基因大肠杆菌菌株的分子特征**
多位点序列分型（MLST）鉴定出15种不同的序列型（ST），其中ST95、ST4383和ST14504最为常见。O血清分型揭示了13种不同的O抗原，O101、O131和O2/O50最为常见。mcr-1基因主要位于质粒上，IncI2是最常见的复制子类型，其次为IncX4、IncHI2和p0111。在8株分离株（主要为APEC）中检测到mcr-1的染色体整合。共检测到5至18个获得性耐药基因（平均13.4个），其中肠道大肠杆菌菌株的平均耐药基因负荷（14.2个）高于APEC菌株（12.9个）。最流行的耐药基因是tet(A)（95.3%）、bla_CTX-M（83.33%）、sul2（79.16%）和floR（75.00%）。

**毒力基因型特征**
关键毒力相关基因的分布显示，iss（87.50%）、ompT（87.50%）、hlyF（83.33%）、iroN（75.00%）和iutA（70.83%）的检出率很高。iucD和papG在所有分离株中均未检出。大多数分离株（91.67%）携带介导过氧化氢耐受的sitABCD操纵子。APEC菌株携带的毒力基因数量为23至38个（平均29.7个），而肠道大肠杆菌菌株携带9至30个（平均23.2个）。

**致病性评估**
在大蜡螟攻击试验中，高剂量接种时，18株分离株（包括13株APEC和5株肠道大肠杆菌）导致幼虫100%死亡。其中12株分离株（包括8株APEC和4株肠道大肠杆菌）即使在低剂量下也能导致100%死亡。值得注意的是，毒力基因数量与致死能力并非严格相关。例如，携带较少毒力决定簇的菌株有时能导致完全死亡，而携带较多基因的其他菌株仅表现出中等毒力。

**讨论与结论总结**
本研究系统表征了2020年至2024年间从江西省患病和健康家禽中收集的24株携带mcr-1大肠杆菌分离株的基因组和表型特征。mcr-1的总体流行率为4.06%，患病家禽中的检出率（5.15%）高于健康家禽（3.00%）。所有分离株均表现出粘菌素耐药和100%的MDR。高耐药率与tet(A)、bla_CTX-M、sul2和floR等获得性耐药基因的存在一致。肠道分离株中广泛携带的耐药基因凸显了健康家禽作为MDR细菌储存库的隐蔽威胁。

分子定位分析显示mcr-1主要位于质粒上，IncI2是最常见的复制子类型。在8株分离株（主要为APEC）中检测到染色体整合。染色体编码的mcr-1通常比质粒携带的拷贝更稳定，这可能促进即使在缺乏直接选择压力的情况下粘菌素耐药的持续存在。质粒介导的流动性和染色体稳定性的结合可能增强mcr-1在家禽相关大肠杆菌群体中的长期存活。

毒力基因分型揭示了与APEC相关的决定簇的高流行率，这些基因涉及铁获取、血清抗性和细胞毒性。然而，经典的毒力基因如papG和iucD在所有分离株中均缺失。这凸显了定义APEC核心毒力标记物的困难，并支持替代因子可能补偿这些常见基因缺失的可能性。

在大蜡螟感染试验中，大多数分离株表现出强致死性，一些肠道共生菌株也导致高死亡率，表明这些分离株可能构成人畜共患风险。值得注意的是，毒力基因数量与致死能力并不严格相关，这反映了模型的局限性以及毒力决定的复杂性。系统发育分析显示APEC和共生分离株之间没有严格的来源特异性聚类，支持了肠道共生大肠杆菌是毒力基因储存库和APEC进化前体的假设。

**研究结论**
本研究首次系统调查了江西省11个城市家禽来源的携带mcr-1大肠杆菌，提供了24株阳性分离株的初步流行病学基线数据，揭示了受试菌株中显著的流行率、广泛的MDR、遗传多样性和致病潜力。患病和健康家禽都是mcr-1的重要储存库，其中肠道大肠杆菌在耐药基因的持续存在中扮演重要角色。质粒携带和染色体整合的mcr-1在基因组中共存，提示了一种具有推定传播性的双重维持机制，这可能使粘菌素耐药在国家禁令下仍得以持续，这需要进一步的功能验证。值得注意的是，高致病性APEC菌株携带高负荷的MDR基因，而一些来自健康家禽的肠道共生大肠杆菌在大蜡螟模型中也表现出强致死性，这表明其对动物和公共卫生存在潜在的双重威胁，值得进一步大规模研究。这些发现为控制当地家禽生产中的粘菌素耐药菌、促进抗菌药物合理使用以及降低公共卫生风险提供了初步的分子流行病学数据和理论基础。建议扩大监测、规范APEC控制并限制耐药菌沿食物链传播，以保障动物和公共卫生。