《Frontiers in Plant Science》：Seed function in space and time: how spatial transcriptomics completes the picture
编辑推荐：
时空基因表达是决定生物生长与功能的底层机制，种子发育与萌发过程亦受此调控。解析这些调控通路在时空维度的运作规律，对挖掘种子组分的功能多样性、改良有益农艺性状至关重要。近年来，空间转录组学技术的突破极大拓展了动植物组织内基因表达的研究边界，但其在种子研究中的应用
时空基因表达是决定生物生长与功能的底层机制，种子发育与萌发过程亦受此调控。解析这些调控通路在时空维度的运作规律，对挖掘种子组分的功能多样性、改良有益农艺性状至关重要。近年来，空间转录组学技术的突破极大拓展了动植物组织内基因表达的研究边界，但其在种子研究中的应用仍十分有限。本文系统梳理了小麦、大麦、玉米、水稻、野大豆及拟南芥等物种发育与萌发阶段种子的空间多组学研究文献，凝练该领域的核心进展与现存挑战。研究人员指出，空间转录组学显著提升了基因表达分析的尺度与分辨率，揭示了转录组如何解析种子完整的组织结构，进而推动新型细胞亚型的发现、时空基因表达梯度的解析，以及跨组织营养转运协同机制的阐明，使种子组成的解析精度达到前所未有的水平。
引言
种子是植物生命周期起始的关键载体，既介导被子植物的遗传扩散，又为萌发幼苗提供能量储备，直接决定植株后续的建成成功率，同时兼具极高的农产品价值与生态保护意义。因此，解析驱动种子发育与萌发的时空基因表达规律，是推进作物改良与生态研究的核心基础。多数被子植物的种子结构起源于双受精过程，形成胚与胚乳两大核心组织。禾本科单子叶作物（如谷类作物）的发育历经核分裂、伸长与细胞化阶段，大型胚乳组织中积累淀粉、蛋白质等贮藏物质，为萌发期的胚提供能量，整个过程被种皮这一第三层保护组织包裹——种皮源于受精时的母本胚珠，与外部果皮细胞融合。双子叶植物如拟南芥的胚乳发育较早，随后在发育过程中被生长的胚消耗，成熟种子由大型胚、薄层残余胚乳及最外层的种皮组成。由于不同组织对种子的功能与营养特性贡献各异，在复杂组织结构背景下解析种子功能的遗传调控机制，将助力更具靶向性的遗传研究。近几十年来，空间基因表达研究主要依赖细胞手动显微解剖结合 bulk 或单细胞RNA测序技术，但这些技术缺乏在组织完整背景下解析单细胞基因表达的精细分辨率，通量较低，且受植物细胞壁限制，原生质体分离面临独特挑战。空间转录组学技术的发展为在时空背景下完整解析基因表达提供了可能。
空间转录组学革新了基因表达研究范式，可在高分辨率、高效率条件下对组织切片内的转录本进行定量，并将其映射回原始的细胞与组织结构框架中。目前已开发出多种空间转录组学平台，其基因表达可视化原理各有不同：原位杂交（in situ hybridisation）基于目标序列与荧光探针的杂交实现位置捕获；原位测序（in situ sequencing）基于挂锁探针在原位对转录本进行测序；原位捕获（in situ capture）则利用空间条形码探针对组织全RNA进行捕获，测序后可将其映射回原始组织结构。这些技术的演化历程、方法学差异及其针对不同目标组织的应用优劣势已被多篇综述系统阐述。在植物研究中，空间转录组学已应用于拟南芥叶片、大麦、玉米、小麦等谷类作物，以及果蔬等组织的研究，极大推动了多物种多组织基因表达认知的深化。但该技术在种子应用中仍存在局限：低丰度表达基因的捕获效率不足；高含水量、高淀粉含量及刚性细胞壁的细胞适用性受限（这是植物组织应用的共性问题）；自荧光干扰（对荧光标记探针类方法影响显著）；多倍体基因组分析与海量数据处理的挑战。鉴于种子的农业与生态重要性，提升种子精细准确转录组数据的捕获能力应成为未来植物科学研究的重点。尽管已有多篇关于空间转录组学助力作物改良的综述发表，但迄今尚无专门针对该技术在种子领域应用的综述。本文系统梳理种子空间转录组学研究，重点阐述各研究对种子发育与萌发机制的核心贡献及面临的技术挑战。
应用部分
小麦是全球农艺价值最高的作物之一，也是空间转录组学研究的核心靶点。研究人员首次利用BMKMANU S1000原位捕获平台，对花后4、8、12天（DPA）的小麦发育籽粒进行空间转录组学分析，鉴定出籽粒结构内的10个核心基因表达簇，并挖掘到参与调控籽粒发育的差异表达基因，其中转录因子TaABI3-B1特异性表达于胚及胚周围区域（ESR），对胚大小与籽粒大小具有反向调控作用。后续研究采用Stereo-seq原位捕获平台，对花后14天（14 DPA）的小麦种子进行空间基因表达分析，同样划分出8个主要基因表达簇，包含4个不同的胚乳簇，其表达谱分别与淀粉合成、蛋白质生物合成及脂质转移活性相关。这些基因表达簇的分布特征与前人研究结果高度吻合，进一步明确了灌浆期淀粉与蛋白质沉积从胚乳内层向外层的空间推进规律，同时揭示了谷醇溶蛋白B（puroindoline-B）与α-淀粉酶抑制因子等品质基因存在亚基因组偏向性表达。近期发表的乳熟期（25 DPA）小麦籽粒转录组图谱整合了单细胞核RNA测序（snRNA-seq）数据，利用BMKMANU S1000平台鉴定出13个转录与空间异质性的细胞簇，发现亚基因组B的表达占主导地位，并证实NAC转录因子是调控贮藏代谢、籽粒成熟及程序性细胞死亡的核心调控因子，空间数据与snRNA-seq的联合分析实现了全面的细胞类型注释。空间转录组学通过为粒重调控、蛋白与淀粉沉积、程序性细胞死亡相关基因提供空间背景，深化了对小麦种子发育的认知，揭示了组织间基因表达协同驱动籽粒建成、构建籽粒物理与功能架构的完整过程。这些发现为下一代作物改良提供了重要框架，但技术挑战依然存在：早期发育阶段低丰度表达基因的捕获能力有限；捕获芯片未针对发育中小麦籽粒组织优化，导致组织边缘翘起，限制了部分细胞区域的转录本定位；多倍体基因组的分析流程仍需简化。不同研究中鉴定到的簇数量差异很可能源于技术捕获效率或聚类分析方法的技术假象，因此该领域亟需标准化的分析步骤（如归一化方法与聚类方法的选择）及原位捕获流程的进一步优化。
大麦的空间转录组学研究最早聚焦于萌发过程，研究人员利用10x Genomics Visium原位捕获平台，分析了吸胀后0、1、3、6、24小时（HAI）的基因表达动态，揭示出胚、糊粉层与胚乳三大核心组织内高度有序的基因表达模式：胚高表达转录、翻译、延伸因子及热休克因子相关基因；糊粉层与胚乳主要富集营养贮藏、淀粉降解及代谢功能相关转录本，包括晚期胚胎发生丰富（LEA）蛋白、γ-醇溶蛋白、α-淀粉酶、α-淀粉酶抑制因子、胰蛋白酶抑制因子及水通道蛋白家族基因。萌发前24小时内，不同组织间鉴定出超过14000个差异表达基因，为水分吸收与营养利用的时空调控机制提供了新的认知。后续研究整合了发育期与萌发期的空间转录组数据，构建了涵盖花后3、6、12、20天（DPA）发育阶段与萌发早期阶段的综合转录组图谱，定量解析了超过20000个基因的转录丰度，鉴定出种子生命周期中多个生物学过程的空间异质性表达特征。尽管捕获斑点尺寸限制了大麦籽粒细胞单细胞分辨率的获取，但该研究是首个覆盖种子发育与萌发全过程的空间分析，为未来大麦靶向遗传研究提供了宝贵资源。
玉米籽粒的空间转录组学研究利用10x Genomics Visium平台，聚焦花后10、14、18天（DPA）韧皮部蔗糖运输后的分配与分布过程。研究人员通过映射籽粒组织的基因表达，鉴定出25个空间异质性的细胞簇，结合组织解剖学图像可划分为11个功能细胞群。多个淀粉合成酶编码基因被鉴定为淀粉质胚乳的标记基因，包括蔗糖合酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶大亚基与小亚基、腺嘌呤核苷酸转运蛋白（BT1）及淀粉合酶1和2；蛋白质贮藏基因在胚乳中高表达，而油脂与脂质贮藏基因主要在胚中表达。玉米基因组中共鉴定出7个蔗糖转运蛋白基因（ZmSUT1、ZmSUT2、ZmSUT3、ZmSUT4、ZmSUT5、ZmSUT6、ZmSUT7），其中ZmSUT1与ZmSUT7在基底胚乳传递层（BETL）特异性表达，可能在韧皮部后蔗糖向胚乳的转运中发挥关键作用。空间转录组数据表明，转运蛋白基因在精确区域表达，将蔗糖卸载与淀粉合成及籽粒营养品质直接关联。这些糖代谢的时空梯度解释了营养分配塑造籽粒组成的精细机制，精度远超传统bulk或单细胞转录组研究。但该研究同样受限于技术的空间分辨率，单个RNA捕获斑点可能包含多个细胞的转录本，单细胞尺度的精细解析仍有待提升。
水稻萌发种子的研究联合应用Stereo-seq与单细胞RNA测序（scRNA-seq），覆盖吸胀后6、24、36、48小时（HAI）的快速吸水期与代谢动员（滞后期），这两个阶段是转录变化最显著的时期。研究人员构建了高分辨率的萌发胚图谱，鉴定出14种不同的胚细胞类型，其中包括2种此前未被表征的盾片细胞类型。研究揭示了细胞组成的动态变化：与根相关的细胞比例随时间增加，部分盾片细胞比例下降。整体基因表达模式从早期的胁迫响应与环境信号通路，逐步转变为后期的细胞周期激活、DNA复制及生长相关通路。激素调控的时空特征也被解析：生长素与赤霉素活性逐渐升高，脱落酸信号逐渐降低，为营养动员做准备。该研究的核心贡献在于联合Stereo-seq与scRNA-seq构建了水稻种子萌发的高精度时空图谱，并开发了基于深度学习的自动化细胞分割方法。但方法学仍存在局限：实验未纳入0 HAI时间点，因干燥种子质地过脆无法进行切片；部分时间点的细胞类型鉴定受切片角度影响存在困难。
野大豆发育种子的研究整合了高通量空间转录组学（10x Genomics Visium平台）、空间代谢组学与scRNA-seq，开展多组学分析，聚焦中期成熟阶段。研究构建了基因表达与代谢产物分布的高分辨率图谱，显示出营养积累的独特空间模式：脂质生物合成通路在背轴区细胞中显著富集，而蛋白质与氨基酸代谢在腹轴区更为活跃。不同细胞类型中存在独特的转录调控程序，揭示了驱动籽粒充实的协同调控网络。配体-受体分析显示，种皮细胞是细胞间通讯网络的调控枢纽。研究还鉴定到关键调控基因GsMAPK23-4，其为子叶中蛋白质与氨基酸积累的负调控因子，敲除突变体中氨基酸与蛋白质水平显著升高。多组学联用突破了传统阶段式发育模型的局限，揭示了细胞间通讯与细胞状态转变的空间规律，实现了代谢产物与离散组织区域的精准关联，阐明了营养积累的空间调控机制。但方法学仍存在局限：分析仅局限于单一发育时间点；scRNA-seq的分辨率不足以清晰注释所有细胞类型的边界，需借助空间转录组数据进行辅助验证。
拟南芥全生命周期转录组研究联合应用空间转录组学与snRNA-seq，构建了从吸胀后0、1.25天（DAI）的种子到角果内47 DAI发育中胚珠的转录组图谱，分别采用Curio Seeker原位捕获技术与MERSCOPE原位杂交技术。研究获得了拟南芥种子功能的大量数据，特别揭示了类黄酮生物合成通路相关基因在发育种子种皮与胚乳中的表达特征。已知类黄酮次生代谢产物参与种皮颜色的调控（如类黄酮合成酶突变体的透明种皮表型），而其在胚乳中的表达可能与胚胎脂肪酸水平的调控相关。这些基因的空间表达模式提示，类黄酮代谢产物在种子不同细胞类型中具有功能多样性。空间转录组学与snRNA-seq的联合分析深化了对拟南芥基因表达的认知，表明转录通路可能与多种细胞类型的次生代谢产物合成相关，但次生代谢通路在拟南芥全生命周期中的调控作用仍需进一步研究。此外，部分研究样本缺乏完善的注释参考数据集，高质量参考数据集的获取将显著提升未来空间转录组学的研究广度。
挑战与未来方向
空间转录组学技术的进步极大深化了对种子发育与萌发背后机制的理解，实现了时空调控通路的高分辨率精细解析，突破了传统技术的局限。种子空间转录组学研究的核心贡献包括：新型细胞群体与细胞亚型的表征；发育阶段与组织类型间基因表达梯度的鉴定；阐明不同组织的基因表达如何决定种子的物理结构、功能与营养特性。空间转录组学揭示了从灌浆进程、胚胎发生到萌发期水分与营养利用时空调控的全新细节，完善了种子发育与新植株生命周期起始的机制认知，将为从种子出发的靶向遗传研究提供支撑，助力农业发展与生态保护。
但种子空间组学应用仍面临技术挑战。目前尚无法在所有发育阶段、所有细胞类型中实现真正的单细胞分辨率：10x Genomics Visium平台的捕获斑点尺寸受植物细胞的异质性尺寸限制，部分组织区域单个斑点会捕获多个细胞的转录本；BMKMANU S1000平台在早期胚胎发育阶段对低丰度表达基因的捕获效率较低；Stereo-seq平台的捕获芯片表面未针对小麦种子组织优化（可能因种子相较于哺乳动物系统具有更高的淀粉与水含量），导致组织边缘翘起，限制了部分细胞区域的转录本定位。因此，原位捕获平台的捕获斑点尺寸、探针设计及表面材料或涂层需针对种子进行优化，以实现更严格的单细胞分辨率。此外，种子特异性的组织制备方案可助力解决转录本捕获难题。值得注意的是，迄今几乎所有种子空间转录组学研究均采用原位捕获技术平台，这可能是因为该类技术可对样本中全部转录本进行测序，工作流程相对简洁，无需像原位杂交那样受限于预设计的目标基因panel，也避免了原位测序复杂的流程与数据分析。同时，原位杂交平台依赖荧光探针对目标序列进行定位，而种子细胞壁（尤其是刚性果皮细胞壁）的天然自荧光会干扰信号检测。因此，优化现有的原位捕获流程可能是填补当前领域空白的最高效路径。
该领域还存在需解决的实践局限：多倍体物种缺乏标准化分析流程、高质量注释参考基因组的可获得性不足、海量数据的计算能力限制。因此，构建重要作物物种的高质量注释参考基因组将提升空间映射的准确性；开发适用于多倍体基因组的精简生物信息学分析流程，并在不同空间转录组数据类型间实现标准化，将显著提升研究的效率与准确性。此外，空间转录组学的高成本限制了大多数实验室的应用，是当前研究规模的主要制约因素——现有研究的组织切片数量、切片方位及发育时间点选择均较为保守。降低平台成本将支持更精细的实验设计，包括多切片方位、多时间点的分析，促进更广泛科学界的参与。鉴于种子的农业与生态重要性，且空间转录组学平台仍在持续演化，针对种子应用的优化应成为未来植物科学研究的核心焦点。通过将基因表达位置与种子结构发育、营养组成、萌发等性状关联，空间转录组学已成为下一代作物改良的新基石。
