GITRL共表达赋予抗CD19 CAR-NK细胞抵抗Treg细胞介导免疫抑制的能力

《Frontiers in Immunology》：Coexpression of GITRL confers resistance to Treg cell-mediated immunosuppression to anti-CD19 CAR-NK cells

　　

摘要

引言：调节性T细胞（Treg）在塑造免疫相互作用中发挥关键作用，其可限制抗肿瘤免疫并削弱工程化效应细胞的活性。克服调节性T（Treg）细胞介导的免疫抑制，对于释放嵌合抗原受体（CAR）细胞治疗的全部治疗潜能至关重要。研究人员在此开发了共表达GITR配体（GITRL）的“装甲化”抗CD19 CAR-NK细胞（CAR19-GITRL-NK），以同时靶向恶性B细胞并在局部对抗Treg介导的抑制。GITR在Treg上高表达，其与配体GITRL结合可调节Treg功能，从而为重编程肿瘤微环境提供了合理策略。

方法：研究人员使用慢病毒载体构建了是否共表达GITRL的抗CD19 NK-92细胞和原代外周血NK（PB-NK）细胞，并评估其功能及治疗潜力。针对CAR19-GITRL-NK-92细胞，分析了其扩增、代谢、细胞毒性、细胞因子分泌、脱颗粒以及体内抗肿瘤潜能。研究人员还检测了CAR19-GITRL PB-NK细胞的细胞毒活性，并在表达FoxP3载体转导的T CD4⁺细胞〔作为Treg细胞模型的iTreg-FoxP3〕存在条件下测定其生长情况。

结果：CAR19-GITRL-NK-92细胞表现出更优的扩增能力和增强的代谢适应性。在功能方面，两种CAR构型均提高了NK-92细胞在体外针对CD19⁺ Nalm-6和Namalwa细胞的细胞毒性及细胞因子分泌。RNA测序（RNA-Seq）显示，与CAR19-NK-92细胞相比，CAR19-GITRL-NK-92细胞中有54个基因上调、34个基因下调；富集通路与免疫激活、增殖、趋化及细胞毒性相关，其中包括NCR2、CD2、CMKLR1、IRF5、KIT和PTPN3表达增加。体内实验中，CAR19-GITRL-NK-92细胞实现了更优的肿瘤控制和最长的总生存期。在原代NK细胞中，CAR19-GITRL增强了对CD19⁺靶细胞的杀伤，而GITRL表达减弱了iTreg-FoxP3对CAR-NK细胞的抑制，提示其具有抵抗Treg抑制的机制。

讨论：综合来看，这些数据表明CAR19-GITRL-NK细胞是一种强有力且具有创新性的策略，可将直接肿瘤靶向与主动削弱Treg驱动的免疫抑制相结合，用于治疗B细胞白血病和淋巴瘤。

本文发表于《Frontiers in Immunology》，聚焦于CAR-NK细胞在免疫抑制性肿瘤微环境中疗效受限这一关键问题，尤其关注调节性T细胞（Treg）对效应细胞的抑制作用。当前，嵌合抗原受体（CAR）修饰自然杀伤（NK）细胞因兼具较强细胞毒作用、较好安全性以及较低移植物抗宿主病风险，已成为肿瘤免疫治疗的重要发展方向。尽管早期临床研究已证明CAR-NK的安全性，但其持续存在能力、体外扩增效率、CAR结构优化以及克服肿瘤微环境免疫抑制等问题仍未解决。既往“装甲化”策略多通过引入细胞因子增强CAR-NK细胞自身增殖和效应功能，但对于Treg主导的免疫抑制缺乏直接干预。基于GITR在Treg细胞上高表达、GITRL可调节其抑制功能的认识，研究人员提出通过在抗CD19 CAR-NK细胞中共表达GITRL，以在靶向B细胞恶性肿瘤的同时局部削弱Treg介导抑制，从而提升细胞治疗效能。

为验证这一设想，研究人员构建了第四代CAR19-GITRL载体，并以不含GITRL的CAR19作为对照，分别转导NK-92细胞和原代外周血NK细胞。研究结果显示，GITRL共表达不仅未损害CAR-NK细胞的扩增、体外杀伤或脱颗粒功能，反而增强了细胞扩增和代谢适应性；在体内B-ALL模型中，CAR19-GITRL-NK-92实现了更好的肿瘤控制和更长生存；在原代PB-NK体系中，该构型还增强了对CD19⁺靶细胞的杀伤，并减轻了iTreg-FoxP3介导的抑制。上述结果表明，GITRL装甲化可同时提升CAR-NK细胞的内在适应性与其在免疫抑制环境中的功能稳定性，对B细胞白血病和淋巴瘤的NK细胞治疗具有重要转化意义。

本研究主要采用以下关键技术方法：研究人员基于慢病毒系统构建并转导CAR19与CAR19-GITRL载体至NK-92及原代外周血NK（PB-NK）细胞，PB-NK和T细胞来源于Ribeir?o Preto血液中心供者外周血单个核细胞；采用流式细胞术进行CAR、GITR、GITRL及功能标志物检测；应用Seahorse平台分析糖酵解和线粒体呼吸；通过细胞共培养、脱颗粒实验、ELISA和RNA测序（RNA-Seq）评价效应功能与转录组变化；使用NSG小鼠Nalm-6-luc异种移植模型评估体内抗肿瘤活性；以FoxP3转导CD4⁺ T细胞建立iTreg-FoxP3模型评估Treg抑制效应。

3.1 Efficient generation of CAR-NK-92 cells coexpressing GITRL
研究人员首先成功构建了由SFFV启动子驱动的CAR19-GITRL慢病毒载体。该CAR包含FMC63来源的抗CD19单链可变片段（scFv）、IgG来源铰链区、CD28跨膜结构域以及CD28/CD3ζ信号结构域，并通过P2A序列实现GITRL共表达。对照载体CAR19不含GITRL序列。NK-92细胞转导后，经流式分选可获得CAR阳性率超过90%的细胞群。值得注意的是，GITRL表面表达仅见于部分CAR阳性细胞，提示其可能受转录后调控或P2A裂解效率差异影响。此外，NK-92细胞中未检测到GITR表达，提示该模型中GITRL不太可能通过经典自分泌GITR-GITRL轴发挥作用。

3.2 CAR19-GITRL-NK-92 cells display enhanced proliferation and metabolic activity
通过22天连续培养，研究人员发现CAR19-GITRL-NK-92细胞扩增最为显著，终末细胞数高于CAR19-NK-92和未转导NK-92细胞；其倍增时间也最短，显示出更快生长动力学。代谢检测进一步证实，CAR表达本身可提高糖酵解，而GITRL共表达使这种变化更加明显。CAR19-GITRL-NK-92细胞具有更高的细胞外酸化率（ECAR），提示糖酵解增强；同时其基础呼吸和ATP生成也显著升高，说明线粒体氧化磷酸化能力更强。研究人员据此认为，GITRL共表达赋予了CAR-NK细胞更优的代谢适应性，这可能是其扩增增强的重要基础。

3.3 CAR-engineered cells displayed increased cytotoxicity against CD19⁺ targets, accompanied by higher degranulation and cytokine release
在体外细胞毒实验中，无论是CAR19-NK-92还是CAR19-GITRL-NK-92，对CD19⁺的Nalm-6和Namalwa细胞均表现出高于未转导NK-92的杀伤能力，而对CD19^? K562细胞未见显著差异，支持其抗原特异性杀伤。脱颗粒实验显示，两类CAR-NK细胞在与CD19⁺靶细胞共培养后CD107a表达均增加，提示细胞毒颗粒释放增强。ELISA结果进一步表明，CAR修饰后细胞在应对CD19⁺靶细胞时TNF-α和IFN-γ分泌升高。该部分结果说明，CAR结构有效提升了NK-92细胞的靶向杀伤、脱颗粒和细胞因子释放功能，而GITRL共表达并未削弱这些效应。

3.4 CAR19-GITRL-NK-92 cells show upregulated immune pathways compared to CAR19-NK-92
为探究GITRL共表达带来的分子机制差异，研究人员对与Nalm-6共培养后的CAR19-NK-92和CAR19-GITRL-NK-92进行了RNA测序。结果显示，CAR19-GITRL-NK-92中共有54个基因上调、34个基因下调。通路富集分析提示，上调基因主要与免疫系统过程、免疫应答、刺激应答、增殖、趋化和细胞毒性相关。其中，NCR2编码活化受体NKp44，CMKLR1与NK细胞趋化相关，IRF5参与IFN应答，KIT支持增殖和存活，PTPN3与NF-κB相关增殖及细胞毒性有关。下调基因则包括抑制性受体CD300A、参与蛋白周转调控的FBXO32以及抑制IL-1信号的IL1RN，提示细胞整体向更活化状态偏移。流式验证显示，CAR19-GITRL-NK-92在基础状态及与Nalm-6共培养后均具有更高的NKp44和CD2表达，支持转录组结论，即GITRL共表达与NK细胞活化和共刺激特征增强相关。

3.5 Antileukemic activity of CAR-GITRL-NK-92 cells in a B-ALL in vivo model
在NSG小鼠Nalm-6-luc急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）异种移植模型中，研究人员比较了NK-92、CAR19-NK-92和CAR19-GITRL-NK-92的体内疗效。结果显示，早期各组差异不明显，但至第15天和第21天，CAR19-GITRL-NK-92组的肿瘤负荷显著更低，提示其具有更优肿瘤控制能力。生存分析进一步表明，CAR19-GITRL-NK-92治疗组获得最长生存。尽管停药后肿瘤仍恢复进展，但结合NK-92体内持续性有限这一已知特征，该结果仍说明GITRL共表达显著增强了CAR-NK细胞的体内抗白血病效应。

3.6 CAR19-GITRL enhances cytotoxic function of primary NK cells against CD19⁺ targets
为评估临床转化潜力，研究人员进一步在原代PB-NK细胞中验证CAR19-GITRL构型。结果显示，PB-NK转导后可获得较高CAR表达，且部分细胞表达GITRL，同时约20%细胞表达GITR。功能实验表明，在1:1效靶比这一更严格条件下，CAR19-GITRL-PB-NK对Nalm-6和Namalwa细胞的杀伤最强，优于PB-NK和CAR19-PB-NK。对于K562细胞，CAR细胞杀伤也高于PB-NK，提示原代CAR19-GITRL-PB-NK处于更高活化状态。该结果证明，GITRL装甲化在原代NK细胞中同样可以增强效应功能。

3.7 GITRL co-expression shows immunomodulatory potential in CAR cells
针对本研究核心问题——Treg介导免疫抑制，研究人员利用FoxP3表达载体将CD4⁺ T细胞诱导为iTreg-FoxP3模型细胞。该细胞群表达FoxP3和GITR，并能抑制T细胞增殖，说明其具备类似天然Treg的功能特征。在此基础上，与iTreg-FoxP3共培养时，CAR19-GITRL-PB-NK所受抑制程度低于CAR19-PB-NK。该结果表明，GITRL共表达能够减弱Treg样细胞对CAR-NK的抑制，提示其具备局部免疫调节潜能，也是本文最具创新性的发现之一。

综合讨论部分可见，本研究证明GITRL装甲化不仅影响CAR-NK细胞外源性抗肿瘤识别，还重塑其内在代谢和转录状态。其优势体现在多个层面：一是细胞扩增更快、代谢适应性更强；二是维持甚至增强了针对CD19⁺靶细胞的特异性杀伤、脱颗粒和细胞因子释放；三是在体内模型中转化为更优肿瘤控制和更长生存；四是在原代PB-NK中表现出更高活性，并能部分抵抗iTreg-FoxP3介导抑制。研究人员同时指出，NK-92中未检测到GITR，因此GITRL相关增强效应可能并非由经典GITR-GITRL自分泌通路介导，其具体机制仍需后续研究澄清。不过，就功能结果而言，GITRL共表达确已赋予CAR-NK更适合免疫抑制环境的治疗特性。

研究结论部分可译为：本研究表明，抗CD19 CAR-NK细胞的GITRL装甲化可带来广泛的功能增强，其作用超越了抗原特异性靶向本身。转录组分析显示，GITRL共表达进一步将基因表达谱重塑为偏向免疫信号、增殖、趋化以及降低抑制性信号的状态。这些内在改良转化为体内更优的肿瘤控制和更长的生存期，尽管NK-92细胞已知存在持续性有限的问题。重要的是，GITRL装甲化所带来的功能优势在原代PB-NK细胞中、尤其在严格效靶比条件及Treg介导抑制背景下更为明显，支持其在免疫抑制环境中的应用相关性。总之，这些发现将CAR19-GITRL-NK细胞定位为一种新一代装甲化CAR-NK策略，其整合了增强的代谢适应性、强有力的抗肿瘤活性以及对调节性免疫抑制的部分抵抗能力，支持进一步开发基于NK细胞的B细胞恶性肿瘤免疫治疗。