《International Journal of Pharmaceutics》：Copper metallodendrimers effectively deliver proapoptotic siRNA to human liver carcinoma HepG2 cells
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Sylwia Michlewska|Marika Grodzicka|Marcin Ho?ota|Angela Dziedzic|Juris Jansons|Jaros?aw Jakubik|Sandra Garcia-Gallego|Paula Ortega|Francisco
Sylwia Michlewska|Marika Grodzicka|Marcin Ho?ota|Angela Dziedzic|Juris Jansons|Jaros?aw Jakubik|Sandra Garcia-Gallego|Paula Ortega|Francisco Javier de la Mata|El?bieta Skiba|Maria Bryszewska|Janusz Blasiak|Maksim Ionov
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铜(II)碳硅烷金属树状大分子能与促凋亡siRNA形成稳定复合物。
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这种树状复合物可将siBcl-2和siMcl-1递送至HepG2肝癌细胞中。
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使用这类树状复合物处理可增加细胞内活性氧水平，并激活caspase 3/7。
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接触树状复合物后，细胞的黏附能力和迁移能力会下降。
引言
凋亡功能的失调是癌症发生及对癌症治疗产生耐药性的重要因素。在癌细胞中，编码BCL2家族蛋白的基因，如BCL2凋亡调节蛋白和MCL1凋亡调节蛋白，常常过度表达（Del Olmo等人，2020年）。虽然Bcl-2主要具有抗凋亡作用，但由MCL1基因编码的诱导髓系白血病细胞分化蛋白Mcl-1，则会根据其mRNA通过可变剪接产生的不同亚型而表现出促凋亡或抗凋亡两种作用。除了能生成主要具有抗凋亡和促凋亡特性的长型Mcl-1L和短型Mcl-1S亚型外，还发现了第三种亚型Mcl-1ES。Mcl-1S和Mcl-1ES缺乏Mcl-1中的部分结构域，具有促凋亡活性，而Mcl-1L则能维持线粒体结构，防止细胞凋亡。
这些亚型功能上的差异源于Bcl-2同源结构域、跨膜区域以及PEST序列的结构差别，而这些结构要素决定了蛋白质的稳定性、定位以及与其他Bcl-2家族成员的相互作用（Warren等人，2019年），进而导致癌细胞中凋亡功能失调。抗凋亡蛋白的高表达可通过抑制细胞凋亡来促进肿瘤细胞存活并增强其对治疗的耐药性（Creixell和Peppas，2012年）。通过RNA干扰技术递送促凋亡siRNA，可选择性沉默抗凋亡基因（Levanova和Poranen，2018年；Mahmoodi Chalbatani等人，2019年）。RNA诱导的沉默复合体会与互补的mRNA序列结合，促使这些序列被切割降解，从而引发细胞凋亡（Malakondaiah等人，2024年）。
由于siRNA带有负电荷，将其递送至目标细胞是其用于治疗时的一个重大挑战（Ferenc等人，2013年；Ionov等人，2015年；Nikam和Gore，2018年；Zhou等人，2006年）。基于siRNA的治疗方法的另一个局限是siRNA容易被核酸酶降解（Creixell和Peppas，2012年；Gao等人，2023年）。因此，使用合适的载体来递送siRNA有助于克服这些难题（Gao等人，2023年）。近年来，树状大分子作为一种非病毒基因递送载体受到了广泛关注（Bia?kowska等人，2021年；Rodríguez-Prieto等人，2021年）。它们结构清晰、单分散性好、免疫原性低、化学和热稳定性高，且对正常细胞的毒性较低，因此很适合作为基因纳米载体（Ho?ota等人，2023年；Ionov等人，2015年；Rodríguez-Prieto等人，2021年）。带正电的树状大分子可以与带负电的siRNA形成复合物，进而生成带正电的纳米复合物，这类复合物既能与带负电的细胞膜结合，又能促进细胞对其的内吞（Bia?kowska等人，2021年；Del Olmo等人，2020年；Rodríguez-Prieto等人，2021年）。此外，与树状大分子形成复合物还能保护siRNA免受核酸酶的降解（Michlewska等人，2018年；Rodríguez-Prieto等人，2021年）。除了传统的阳离子树状大分子外，还有其他多种非病毒平台被用于核酸递送，比如脂质纳米颗粒，它们正是目前临床上获批的新冠mRNA疫苗的基础（Hou等人，2021年）；还有单组分可离子化的两亲性Janus树状大分子，这类分子只需简单注射就能与mRNA共同组装成树状大分子纳米颗粒，能够以具有器官选择性的方式在体内高效递送mRNA（Percec等人，2010年；Zhang等人，2021年）。PAMAM树状大分子、聚赖氨酸树状大分子、磷基树状大分子以及钌基树状大分子也都被广泛研究用于递送siRNA、反义寡核苷酸以及CRISPR相关物质（Biswas和Torchilin，2013年；Sarode和Mahajan，2024年；Shcharbin等人，2020年）。在所有这些递送系统中，碳硅烷金属树状大分子因其结构中嵌入的金属复合物具备天然的抗癌活性，因而可能进一步强化siRNA的基因沉默效果，具有独特的优势。
目前，人们正在研发含有具有抗癌特性的金属离子的新型金属树状大分子，这些金属离子包括金、钌和铜等（Ho?ota等人，2023年；Ho?ota等人，2019年；Michlewska等人，2023年；Sanz del Olmo等人，2020年）。其中，铜因其在生物体内的关键作用以及良好的生物相容性而备受关注。它是众多生物分子的组成部分，在多种生化反应中发挥着重要作用（Pe?a等人，2019年）。含铜化合物以其能够诱导癌细胞凋亡的特性而闻名（Mehmud等人，2025年；Zhang和Peng，2025年）。铜会在细胞内产生活性氧，进而引发氧化损伤，包括DNA断裂，从而发挥抗增殖作用（Jopp等人，2017年；Sanz del Olmo等人，2017年）。由于癌细胞内的氧化还原平衡被打破，活性氧水平通常会升高，因此它们可能对氧化应激更为敏感，不过这种敏感性也会因肿瘤自身的抗氧化能力以及适应性机制的不同而有所差异（Zhang和Peng，2025年）。
铜(II)金属树状大分子能够与siRNA分子形成稳定的复合物（Michlewska等人，2018年；Rodríguez-Prieto等人，2021年）。因此，含有铜原子的树状大分子有望成为将促凋亡siRNA递送至癌细胞中的理想载体（Del Olmo等人，2020年）。在本研究中，我们评估了带有氯离子和硝酸根配体的碳硅烷铜(II)金属树状大分子作为促凋亡siRNA递送载体的应用潜力，以及这类siRNA/树状大分子复合物诱导细胞凋亡的效果。此外，我们还研究了这类siRNA/树状大分子复合物抑制癌细胞黏附和迁移的能力。
章节要点
siRNA与树状大分子
本研究中使用了两种类型的siRNA：未经修饰的和经过荧光素异硫氰酸酯标记的促凋亡siRNA。第一种是si-Mcl-1，其序列为：正义链：5′-GGACUUUUAUACCUGUUAU 3′，反义链：5′-AUAACAGGUAUAAAAGUCC 3′；另一种是si-Bcl-2，其序列为：正义链：5′-GCUGCACCUGACGCCCUUC 3′，反义链：5′-GAAGGGCGUCAGGUGCAGC 3′。这些siRNA是从美国科罗拉多州拉斐特的Dharmacon公司购买的。
用于构建siRNA/树状大分子复合物的铜(II)金属树状大分子是按照先前的方法合成的（Sanz del Olmo等人，2017年）：
细胞毒性
本研究检测了siRNA（siBcl-2和siMcl-1）、铜(II)金属树状大分子（CCD Cl-1、CCD Cl-2、CCD NO-1、CCD NO-2）以及它们形成的siRNA/树状大分子复合物对人外周血单核细胞和肝癌细胞HepG2的细胞毒性。
将未形成复合物的siRNA或树状大分子与这两种细胞共培养后，没有观察到任何负面影响（见图2 A、B）。不过，虽然这些siRNA/树状大分子复合物对外周血单核细胞没有毒性，但却显著降低了
讨论
本研究的结果表明，铜(II)金属树状大分子作为促凋亡siRNA的递送载体，在治疗肝癌方面具有巨大潜力。这类纳米结构的主要优势在于它们能够与siRNA形成稳定复合物，保护核酸免受核酸酶的降解，同时还能促进核酸在细胞内的有效递送（Del Olmo等人，2020年）。此外，铜(II)离子的存在还能通过产生活性氧来进一步增强治疗效果
结论
碳硅烷铜(II)金属树状大分子能够有效地将促凋亡siRNA（siBcl-2和siMcl-1）递送至HepG2细胞中。未形成复合物的siRNA和树状大分子仅能产生微弱的作用，而相应的siRNA/树状大分子复合物，尤其是那些由第二代树状大分子构成的复合物，却能引发强烈的生物学反应：使HepG2细胞的存活率降至对照组的约40%，使BCL2和MCL1 mRNA的表达水平下降3.5到4.9倍，同时还能提升细胞凋亡
CRediT作者贡献说明
Sylwia Michlewska：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，方法学，研究工作，资金获取，概念构思。Marika Grodzicka：研究工作。Marcin Ho?ota：撰写——初稿，研究工作，正式分析。Angela Dziedzic：研究工作，正式分析。Juris Jansons：研究工作。Jaros?aw Jakubik：撰写——审阅与编辑，研究工作。Sandra Garcia-Gallego：资源提供。Paula Ortega：资源提供。Francisco Javier de la Mata：无贡献。
资助情况
本研究得到了波兰国家科学中心“MINIATURA7”项目以及欧盟的“地平线2020”研究与创新计划的资助，相关资助协议编号为685451，IDUB编号为44/2021。该资助还包含了波兰大学享有的2%额外补贴，资金来自波兰科学与创新部（参考编号PID2020-114891RB-I00），项目编号为EPU-INV-UAH/2021/002。卡斯蒂利亚-拉曼查自治区政府也提供了资助，编号为SBPLY/23/180225/000109。CIBER-BBN则是西班牙第六个国家研发计划资助的项目
未引用参考文献
Kharangate和Shende，2023年；Michlewska等人，2017年。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢波兰罗兹医科大学健康科学学院生物医学化学系的Jagoda Jakubik硕士在研究过程中给予的帮助。
