综述：mRNA的修饰与损伤及其对基因表达和信号转导的影响

《Journal of Biological Chemistry》：Wanted and unwanted modifications of mRNA, and their effect on gene expression and signaling

RNA在遗传信息的传递、解码以及转录和翻译过程中的催化功能中发挥着重要作用。聚合物的功能由其四种核碱基的独特结构决定，这些结构决定了分子如何与自身、其他RNA和蛋白质相互作用。因此，碱基的修饰通常会通过改变这些相互作用来影响RNA功能。尽管人们几十年来已经知道tRNA、rRNA和mRNA会发生修饰，但近期研究揭示了mRNA内部修饰在其功能重要性方面的更多细节。除酶介导的修饰外，mRNA还易受到损伤诱导的改变。这些改变源于内源性和外源性的烷基化、氧化和交联剂，以及紫外线（UV）辐射的暴露。许多修饰严重破坏tRNA-mRNA相互作用，常常导致核糖体停滞。本综述的一个核心主题是：酶促修饰和损伤诱导的修饰均被细胞主动感知，其中损伤诱导的修饰尤其会激活专门的质量控制通路和应激反应程序，以调控基因表达和细胞命运。本综述首先讨论最丰富的酶促mRNA修饰及其对翻译的影响，然后转向损伤诱导的损伤以及解决这些问题的核糖体依赖性质量控制机制。最后讨论受损mRNA通过影响核糖体碰撞来激活整合应激反应（ISR）和核糖毒性应激反应（RSR）从而重编程基因表达、并在严重条件下决定细胞命运的重大发现。

**RNA修饰**

RNA分子被发现后不久，研究人员即认识到细胞RNA中存在多种超出四种经典核苷酸（腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷）的核苷酸。近二十年来，得益于质谱和RNA测序技术的进步，天然修饰核苷酸的列表不断扩展。目前估计细胞RNA含有接近200种修饰核苷酸。这些修饰中tRNA拥有最多，其次是rRNA，mRNA远居第三。RNA分子在其5'端和3'端以及内部的碱基、核糖和磷酸骨架上均可发生修饰。最简单的修饰包括异构化反应、甲基基团的添加以及碱基的脱氨作用。更复杂的修饰涉及在核碱基和核糖骨架的不同原子上添加多个 bulky 基团，甚至整个氨基酸。修饰在tRNA和rRNA功能中发挥重要作用，包括解码、肽键形成和肽链释放等关键功能，同时也改变RNA分子的稳定性及其与其他RNA和蛋白质的相互作用。

**mRNA加帽**

RNA转录本在细胞核中开始合成后，会发生一系列必要的修剪、修饰和加工事件。对于mRNA，这些修饰包括5'端加帽、3'端多聚腺苷酸化和剪接。这些修饰完成后，成熟的mRNA被输出到细胞质中，参与蛋白质合成或被RNA降解机制靶向。值得注意的是，所有这些修饰都是共转录发生的，利用了RNA聚合酶II（RNAP II）的独特结构和调控特性。

新生pre-mRNA的加帽发生在RNAP II开始转录仅20-30个核苷酸后。整个反应至少需要三个酶促步骤：首先，RNA三磷酸酶去除pre-mRNA 5'三磷酸的γ-磷酸；其次，鸟苷酸转移酶将GMP从GTP转移到mRNA 5'端的β-磷酸，形成5'-5'三磷酸连接；最后，通过RNA甲基转移酶的作用在末端鸟嘌呤的N7位添加甲基，形成最小的帽0（cap 0）结构。帽0结构对下游的mRNA剪接和多聚腺苷酸化至关重要，这通过招募核帽结合复合物（CBC，由CBP20和CBP80组成）来实现。CBC通过与剪接体U4/U6.U5 tri-snRNP的相互作用促进pre-mRNA剪接，同时参与mRNA 3'端形成和多聚腺苷酸化。加工完成后，CBC结合的mRNA被输出到细胞质，此过程中CBC通过与转录输出（TREX）复合物等核输出因子的相互作用发挥直接作用。

在细胞质中，帽结构被eIF4F复合物的起始因子eIF4E识别，这是mRNA激活和招募小核糖体亚基进行经典起始所必需的步骤。同时，帽结构使mRNA抵抗5'-3'外切核酸酶（XRN1）的外切核酸降解作用，除非帽结构被脱帽酶去除或mRNA被内切核酸酶切割。

最小帽0结构对mRNA的输出、稳定和翻译很重要，但该结构通常还会进一步修饰，特别是在+1和+2位置。最常见的修饰是mRNA 5'端核苷酸的2'-O-甲基化，形成所谓的帽1（cap 1）结构，其在区分自身与非自身mRNA中发挥作用。模式识别受体（PRRs）RIG-I和MDA5识别病毒RNA并激活下游干扰素反应，而帽1结构的存在抑制了它们的结合。

某些以腺苷起始的帽1结构mRNA可进一步修饰。除2'-O-甲基化外，末端核苷酸的碱基可在N6位甲基化，形成N⁶,2'-O-二甲基腺苷（m⁶A_m）。N⁶-甲基化共转录发生，通过甲基转移酶PCIF1与RNAP II的Ser5磷酸化CTD相互作用被招募到起始RNA聚合酶。该修饰可通过氧化去甲基酶FTO的作用逆转，表明这种甲基化是动态的，可用于调控修饰mRNA的表达。有趣的是，该修饰抑制DCP2催化的mRNA脱帽。然而，关于m⁶A_m甲基化如何影响mRNA功能仍存在争议。

除经典的共转录加帽外，一些转录本被证明以烟酰胺通过5'-5'二磷酸连接到末端腺苷的方式加帽。这种加帽方式在酶学上与经典加帽不同，不需要额外的机制来整合。最可能的情况是，当pre-mRNA以末端腺苷起始转录时，RNAP II有时使用NAD⁺——一种在一端带有腺苷的二核苷酸帽——代替ATP开始转录。NAD⁺加帽的功能目前尚不完全清楚。该修饰抑制帽依赖性翻译，并通过脱帽酶DXO去除。

**N⁶-甲基腺苷（m⁶A）**

N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰是mRNA中最丰富的内部修饰，约占总腺苷的1%，每个mRNA平均含有3-4个修饰位点。值得注意的是，m⁶A是少数拥有专门mRNA特异性沉积机制的修饰之一。几乎所有其他内部mRNA修饰（脱氨除外）都重复利用tRNA和rRNA修饰酶。m⁶A修饰在半个多世纪前通过用放射性标记甲基供体前体对肝细胞瘤细胞进行代谢标记而发现。与tRNA和rRNA含有复杂的甲基化核苷酸混合物不同，mRNA几乎只含有m⁶A这一种修饰。

过去十年，由于发现m⁶A可被氧化去甲基酶FTO和ALKBH5去除，加上m⁶A RNA测序定位技术的发展，m⁶A受到广泛关注。该修饰由甲基转移酶复合物（"写入"复合物）共转录地沉积在pre-mRNA上，该复合物包括METTL3、METTL14和WTAP。m⁶A位点是保守的，可通过与"阅读"蛋白的相互作用调控RNA代谢的多个方面。

早期定位研究发现该修饰发生在mRNA序列的各个区域，但在3'-UTR终止密码子周围富集。尽管如此，CDS区域也会被修饰，原则上可以在延伸过程中影响核糖体对tRNA的选择。虽然N⁶腺苷的甲基化不改变其碱基配对偏好，但它略微降低RNA双链稳定性。因此，该修饰破坏密码子-反密码子相互作用，这反映在细菌体外系统中肽键形成速率的总体降低，从而略微增加错误频率。总体降低程度是上下文依赖的，可从三倍到四十倍不等。然而，在程序化为经典m⁶A RRACH位点的核糖体上，肽键形成的降低约为十倍。

原则上，这种肽键形成的减缓可能已进化为调控共翻译事件（如蛋白质折叠），但修饰位置与蛋白质结构域间区域的相关性尚未确定。更近的研究表明，A的甲基化触发共翻译mRNA降解，这是由核糖体减速解码引发的，被称为CDS-m⁶A降解。这些观察结果似乎与先前显示CDS区域m⁶A虽减缓核糖体解码但通过与"阅读"蛋白YTHDC2促进翻译的数据不一致。不同研究组的这些矛盾结果是m⁶A领域的常见主题，可能是由于修饰的上下文和与修饰相关的分层复杂性。

另一项更近的研究提出了m⁶A在CDS中通过诱导核糖体碰撞启动mRNA降解的额外模型。CDS中m⁶A频率驱动的明显mRNA停滞导致转录本上核糖体堆积，最终招募YTHDF进行m⁶A mRNA在P小体中的储存或降解。YTHDF蛋白如何识别碰撞的核糖体尚不完全清楚。

值得注意的是，同时期Linder等人的研究发现了将m⁶A修饰mRNA与特定tRNA摆动尿苷修饰联系起来的额外调控层。作者表明，tRNA中的mcm⁵s²U修饰增强了携带对应m⁶A密码子的解码效率。这种协同相互作用减轻了通常由m⁶A引起的翻译减缓，结果可以减少m⁶A依赖性mRNA降解。这些发现表明了一种机制，即某些m⁶A修饰转录本可能逃避降解，特别是在tRNA修饰通路通常上调的增殖性癌细胞中。通过mcm⁵s²U提高解码效率，癌细胞可能选择性稳定支持生长和存活的m⁶A标记mRNA。

如前所述，m⁶A主要存在于mRNA的3'-UTR中，在那里它通过阅读蛋白的作用调控翻译。早期研究表明m⁶A通过与真核起始因子（eIFs）存在下的YTHDF1结合形成环化来促进mRNA激活和翻译。后来的研究则认为YTHDF蛋白与m⁶A的结合不改变翻译效率，而是促进mRNA降解。与这些论点一致，更近的研究报告了m⁶A水平与核糖体占据之间的负相关，并提示该修饰通过与RNA结合蛋白IGF2BPs的结合促进其定位于翻译抑制的P小体中。

除CDS和3'-UTR外，m⁶A也存在于mRNA的5'-UTR中，尽管水平远低于其他区域。在一项引人注目的研究中，显示5'-UTR中的单个m⁶A可以在缺乏帽结合起始因子eIF4E的情况下招募核糖体。提出这种帽非依赖性翻译起始依赖于起始因子eIF3直接结合m⁶A并在eIF4G不存在的情况下被招募到mRNA，而eIF4G在正常条件下需要eIF4E才能存在。由于eIF3是核糖体前起始复合物（PIC）的组成部分，这一模型提供了一种内部核糖体进入位点（IRES）类型的起始。

与对tRNA选择的影响相比，关于m⁶A对肽链释放影响的研究较少。然而，在体外，已显示该修饰存在时终止因子催化的终止密码子终止效率降低约六倍。值得注意的是，近终止密码子上的终止效率仅降低三倍。这些观察被用于提出m⁶A降低核糖体上肽链释放保真度的观点。然而，考虑到准确性仅适度（两倍）降低，m⁶A对释放因子活性的影响是否具有生理学相关性尚不清楚。更重要的是，终止密码子不含甲基转移酶复合物识别的经典序列基序，因此不被高水平修饰。因此，m⁶A调控细胞中翻译终止的可能性很低。

**腺苷脱氨为肌苷**

最初通过其编辑双链RNA（dsRNA）的能力发现，作用于RNA的腺苷脱氨酶（ADARs）催化核苷酸碳6上的水解攻击，将其转化为肌苷（图2B）。脱氨反应改变了核苷酸的碱基配对偏好。值得注意的是，相关的作用于tRNA的腺苷脱氨酶（ADATs）修饰tRNA反密码子的摆动位置A34，扩展了修饰tRNA识别的密码子范围。人类有两个具有催化功能的ADAR：ADAR1普遍表达，在先天免疫反应中起关键作用，抑制对自我RNA的抗病毒反应的激活；ADAR2在脑中表达，在mRNA重编码中起主要作用，特别是谷氨酸受体（GluR-B）转录本。

直到最近，人们认为肌苷明确解码为鸟苷，因其与这种核苷酸的相似性。然而，更近的研究表明，类似于修饰在tRNA上的行为，肌苷可根据其序列上下文和密码子内的位置解码为尿苷和腺苷。这种改变的碱基配对的结构基础目前尚不清楚。尽管如此，尽管大多数编辑发生在非编码RNA（Alu重复元件）、内含子和3'-UTR中，已在人类mRNA的编码区域鉴定出超过1500个编辑位点。然而，这些位点的编辑水平较低（平均5%），40%的位点位于Alu样元件中。因此，这些位点修饰的生理作用仍有待揭示。

**tRNA和rRNA修饰酶在mRNA上沉积修饰**

除5'-加帽、m⁶A修饰和腺苷脱氨外，近期进展在所有生命域的mRNA中鉴定出几种修饰。然而，这些修饰不使用mRNA专用机制，而是利用通常靶向rRNA和tRNA的酶。此外，与mRNA特异性修饰不同，这些"泛RNA"修饰在mRNA中丰度较低。虽然假尿苷可以以相对较高频率（10-30%）沉积在mRNA的特定位点，但其他修饰的化学计量通常低于1-5%。因此，目前尚不清楚这些修饰在多大程度上是细胞为改变基因表达而程序化的，还是tRNA-rRNA修饰机制的脱靶结果。

尽管如此，鉴于对假尿苷的极大兴趣，简要讨论这一修饰及其对mRNA翻译的影响。假尿苷是总RNA中最丰富的修饰，分别占tRNA和rRNA总尿苷的约30%和约9%。假尿苷化反应需要尿苷到假尿苷（Ψ）的异构化，即碱基N1与糖C1'之间的糖苷键被裂解并替换为C5-C1'键。因此，该修饰不改变碱基的Watson-Crick碱基配对偏好。尽管在双工RNA小沟的1位添加氨基改变了三级相互作用，并被证明有助于螺旋内的堆积从而稳定螺旋。

一些关于mRNA假尿苷化对其翻译影响的初步研究由Karikó和Weissman进行。这些努力是由该修饰的治疗应用及其规避细胞先天免疫的能力驱动的。尽管如此，这些研究表明所有尿苷被假尿苷替代的mRNA可被核糖体有效翻译以产生完全功能的蛋白质，表明该修饰既不显著改变蛋白质合成的速度也不改变其保真度。与这些观察相反，Karijolich和Yu的研究表明假尿苷修饰的终止密码子通过促进tRNA对密码子的误读导致升高的通读。

**RNA的化学损伤及其后果**

与DNA中发生的情况类似，RNA的核碱基也易受各种细胞代谢物和外源性试剂的修饰。事实上，相对于DNA，聚合物表现出更明显的化学损伤易感性。这源于RNA的几个内在特征，包括其丰度、总体结构及其与蛋白质的相互作用或缺乏 thereof。在典型细胞中，RNA及其NTP前体可能比DNA及其dNTP前体丰富一个数量级以上。此外，与DNA双链的碱基配对性质不同，RNA平均30-40%为单链，将核碱基的Watson-Crick面暴露给反应性化学物质。在真核生物中，DNA进一步受到与组蛋白的结合及其核定位的保护，而RNA更易暴露，直接可被线粒体代谢物等损伤试剂接近。

**氧化**

氧化损伤源于RNA与活性氧（ROS）的反应，ROS可以是细胞代谢和环境的副产物。内源性产生ROS的最重要来源是线粒体。在细胞呼吸过程中，电子可能过早地从电子传递链泄漏，与氧反应形成超氧阴离子（O₂^•-），通常被称为初级ROS，随后产生更强大的次级ROS如羟基自由基（^•OH）、过羟自由基（^•HO₂）和过氧化氢（H₂O₂）。无论其来源如何，这些高反应性物质对核碱基具有很强的攻击性。常见修饰包括8-氧-7,8-二氢鸟苷（8-oxoG）、8-氧-7,8-二氢腺苷（8-oxoA）、二氨基-4-羟基-5-甲酰氨基嘧啶（FapyGua）、4,6-二氨基-5-甲酰氨基腺嘌呤（FapyAde）、5-羟基尿苷、5-羟基胞苷和胞苷乙二醇。其中，8-oxoG因其高丰度而突出，因为鸟嘌呤在四种碱基中具有最低的还原电位。

该修饰不直接改变鸟嘌呤的Watson-Crick面，那么它如何影响碱基配对性质进而影响核苷酸的功能呢？C8位羰基的引入与C5位磷酸骨架产生空间位阻，破坏了经典的反式构象。几十年来，已知在DNA中该修饰导致核苷酸偏好顺式构象，这改变了氢键结合并使8-oxoG在DNA复制期间与腺苷形成Hoogsteen碱基对。

**烷基化**

除氧化损伤外，核碱基对烷基化试剂的修饰高度敏感。内源性烷基化试剂S-腺苷甲硫氨酸（SAM）特别值得注意，因其相对较高的细胞内浓度（毫摩尔范围），导致其与核酸和其他生物分子的非酶促反应性。其他内源性烷基化试剂包括亚硝化胺和胆汁酸的分解产物，它们形成损伤核酸的高反应性内酯。环境烷基化试剂包括卤代烃和烟草烟雾的副产物。然而，一些最重要的外源性烷基化损伤来源是化疗药物，包括环磷酰胺、链脲佐菌尼和替莫唑胺。

在烷基化加合物中，O-烷基修饰是特殊的，因为它们既能致突变又能遗传毒性。例如，在DNA复制过程中，O⁶-甲基鸟苷（O⁶-mG）容易与胸苷错配，形成的几何结构与Watson-Crick碱基对几乎无法区分。相比之下，核碱基Watson-Crick面或小沟的N-烷基化通常阻止适当的碱基配对和聚合酶识别，因此仅具遗传毒性。

在mRNA中，O⁶-甲基化被发现通过与反密码子中的尿苷碱基配对促进错码，但仅当位于密码子的第一和第三位时。值得注意的是，无论O-甲基化与否，G•U碱基对在第三位都被容忍。与第一和第三位相比，密码子第二位的鸟苷O⁶-甲基化完全抑制tRNA选择。这些观察结果与密码子第二位的解码机制一致，这需要与解码中心核苷酸的多个复杂相互作用。它还表明核糖体在密码子-反密码子识别期间可能比复制聚合酶更"挑剔"。

**紫外线照射和蛋白质交联**

核酸的UV损伤是一个众所周知的生物学现象。关于UV介导的RNA损伤的早期见解来自体外实验，显示UV处理的RNA含有修饰核苷酸和二聚体。现在普遍认为UV通过光化学反应诱导转录组范围的RNA损伤，产生嘧啶二聚体、共价RNA-RNA和RNA-蛋白质交联，以及氧化修饰和其他光产物。这些加合物对核糖体功能的大多数影响尚未被广泛探索，但考虑到嘧啶二聚体等损伤对双链结构的剧烈影响，可以安全地说光产物可能会使翻译核糖体停滞。确实，哺乳动物细胞的UV照射导致RNase抗性的二体结构积累，这是核糖体停滞的标志。

与UV诱导的RNA交联不同，RNA也易受到其他交联剂的攻击。这包括甲醛，它是氧化脱甲基等某些生物反应的副产物。自发和烷基化诱导的脱嘌呤也可导致RNA之间以及RNA与蛋白质之间的交联形成。研究RNA交联损伤后果的一个主要挑战是DNA也经常受到这些交联剂的影响。Stingele实验室的最新工作通过使用核碱基类似物4-硫尿嘧啶克服了这一挑战，该类似物仅整合入RNA中，并已被广泛用于光激活核糖核苷增强交联（PAR-CL）中的蛋白质-RNA相互作用研究。

**受损/异常mRNA的质量控制**

在关于mRNA损伤对核糖体功能影响的工作之前，已经知道异常mRNA会受到快速降解它们的质量控制过程的影响。值得注意的是，类似于利用停滞的RNAP II识别阻碍其沿DNA模板移动的损伤的转录偶联核苷酸切除修复（Tc-NER），这些通路大多利用核糖体来检测mRNA中的缺陷。

与本讨论最相关的是无义介导的mRNA降解（NGD），顾名思义，该通路在对导致核糖体无法前进的mRNA作出反应时被激活。NGD最初在含有阻碍核糖体移动、抑制性密码子、稳定茎环结构和poly-A束的序列和/或结构元件的mRNA报告基因背景下研究。更近的研究明确显示该通路在mRNA化学损伤时被激活。在其缺失时，核苷酸加合物在聚合物上积累，细胞对损伤试剂变得敏感。

**停滞的核糖体在碰撞后被泛素化**

值得注意的是，真核生物对核糖体停滞的反应最初是在其对缺陷mRNA和由此产生的不完整新生肽的后果背景下研究的。停滞核糖体如何被识别，直到发现异常mRNA和编码蛋白的质量控制依赖于酵母中的E3连接酶Hel2（哺乳动物中为ZNF598）才得到澄清。确实，该因子的缺失被发现导致对停滞序列的通读和停滞mRNA报告基因的稳定化。后来的研究确定连接酶的底物是核糖体蛋白；Hel2/ZNF598向多个核糖体蛋白添加K63连接的泛素链，包括uS10、uS3和eS7。其中，uS10的泛素化对核糖体质量控制（RQC）最为关键。它作为招募所需下游因子的枢纽，这些因子是稳健降解缺陷mRNA和肽以及拯救停滞核糖体所必需的。

鉴于其与核糖体的亚化学计量比，Hel2如何识别停滞核糖体与翻译核糖体是一个挑战。同样重要的是，短暂的停滞事件很常见，在基因表达中发挥重要作用，包括共翻译折叠和蛋白质靶向。因此，Hel2仅识别有问题mRNA上停滞的核糖体至关重要。关于Hel2底物核糖体特异性的关键洞察来自研究人员团队的工作，其中显示仅在促进核糖体碰撞的条件下才发生稳健的核糖体蛋白泛素化。这发生在滞后核糖体撞上领先停滞核糖体时。Hegde、Inada和Beckman团队的结构研究表明，这种碰撞导致独特的核糖体-核糖体界面，可能被E3连接酶识别。

**无义介导的mRNA降解（NGD）在核糖体停滞后被激活**

大约二十年前，远早于发现停滞核糖体被Hel2泛素化，Doma和Parker展示了酵母中使核糖体停滞的mRNA报告基因以翻译依赖性方式被去稳定化。此前认为RNA降解主要通过内切核酸酶切割进行，因为在没有外体3'-5'降解和Xrn1 5'-3'降解的情况下，5'和3'降解中间体分别积累。这些中间体的测序将切割反应定位在停滞序列上游。虽然停滞mRNA的切割在酵母中似乎稳健发生，但这种反应在哺乳动物中尚未观察到。

最近的数据显示RNA降解主要由Xrn1执行，它似乎由Syh1（哺乳动物中为GIGYF1）招募到缺陷mRNA。在Xrn1缺失时，缺陷mRNA的去稳定化通过上述内切核酸酶反应完成，该反应在酵母中由Cue2（哺乳动物中为N4BP2）催化。该蛋白通过其N端泛素结合域（Cue和UBA域）直接招募到泛素化的停滞核糖体。一旦到达那里，该蛋白使用其C端SMR水解酶域（也与细菌起始因子3的C端同源）切割碰撞核糖体A位附近的mRNA。切割位置与早期定位数据一致，显示它发生在主要停滞核糖体上游。

**RQC触发器（RQT）在核糖体停滞后解离两个亚基**

尽管缺陷mRNA及其编码肽对维持细胞蛋白质稳态构成风险，但它们保留多个核糖体并使其远离翻译池的能力可能对细胞稳态更为有害。因此，RQC和NGD与下游核糖体救援紧密偶联，通过两个亚基从缺陷mRNA上的解离反应来实现。

酵母中的早期遗传学研究鉴定了这一过程中的关键参与者，而最近的生化和结构研究为这些因子如何促进核糖体解离和亚基回收提供了重要见解。停滞后至少发生两种明显的回收途径。在Cue2切割后跑到mRNA末端的尾随核糖体上，Dom34（哺乳动物中为Pelota）和Hbs1与经典回收因子Rli1（哺乳动物中为ABCE1）协同工作以促进核糖体解离。Dom34和Hbs1是同源的，在结构上与释放因子eRF1和eRF3相关。然而，Dom34缺乏允许eRF1识别终止密码子并在核糖体活性位点催化肽链释放的关键结构域，这与该因子应显示无mRNA序列偏好的观点一致。

另一方面，含有ATP依赖性Ski2样RNA解旋酶Slh1（哺乳动物中为ASCC3）的RQC触发器（RQT）复合物解离主要停滞的核糖体，与Dom34/Hbs1/Rli1不同，它需要具有可及3'端的完整mRNA。在酵母中，RQT复合物由Slh1、含泛素结合CUE域的蛋白Cue3（哺乳动物中为ASCC2）和含锌指蛋白Rqt4（哺乳动物中为TRIP4）组成。人类含有额外的蛋白质ASCC1，与其他因子一起形成ASC-1复合物。Cue3被认为使用其泛素结合域结合核糖体上的K63连接泛素链，并将分裂复合物招募到停滞的核糖体。与此观点一致，该复合物与核糖体的结构显示Cue3与Rqt4协同结合在uS10附近，而uS10是Hel2介导泛素化的主要底物，也是下游RQC启动所必需的。

**RQC回收大亚基并将新生肽靶向蛋白酶体降解**

RQT（ASC-1）复合物分裂碰撞核糖体后产生游离的40S亚基，准备重新用于翻译。另一方面，必须处理肽酰-tRNA结合的60S亚基才能完全回收。特别是，不完整肽经历泛素化和蛋白酶体降解——而其被弹出后，tRNA也被回收。

该过程的关键参与者之一是E3连接酶Ltn1（哺乳动物中为Listerin），负责在大亚基上泛素化新生肽。与其辅因子Rqc2（人类中为NEMF）一起，它通过在小亚基缺失时才可能的亚基间桥处相互作用，来区分肽酰-tRNA结合的大亚基与参与翻译的大亚基。Rqc2还具有非模板添加丙氨酰和苏氨酰残基到C端的额外活性。这种所谓的CAT尾化过程被认为将所需赖氨酸残基定位在Ltn1的活性位点。或者，在完全缺乏赖氨酸残基的情况下，Rqc2的CAT尾化可以在没有泛素化的情况下作为降解标签。其他人认为它也可以导致新生肽的聚集。除Ltn1和Rqc2外，该复合物还含有Rqc1（人类中为TCF25），它与Ltn1（Listerin）的RING结构域相互作用并对泛素化反应施加K48特异性。

新生肽提取由AAA ATP酶Cdc48（哺乳动物中为VCP）及其辅因子完成，在Vms1（哺乳动物中为ANKZF1）对肽酰tRNA的CCA端进行内切核酸酶切割之后。修剪的tRNA首先由ELAC1和ANGEL2修复，它们去除Vms1留下的2',3'环磷酸基团，然后由TRNT1添加CAA，完成tRNA的回收。

**RNF14和RNF25 E3连接酶是解析mRNA-蛋白质交联上停滞核糖体所必需的**

UV和醛诱导的mRNA-蛋白质交联（mRPCs）在mRNA的CDS区域内引入翻译障碍，原则上类似于化学修饰mRNA上所经历的障碍，但有一个重要区别。一方面，它们导致停滞并最终碰撞，进而激活RQC以拯救停滞的核糖体并将新生肽靶向降解。另一方面，交联蛋白对下游的RNA降解机制构成障碍，因此需要被移除。两个团队显示，在这些条件下，两种E3连接酶被招募到人类细胞中的核糖体以解析mRPCs。RNF25泛素化核糖体蛋白eS31，这对RNF14泛素化交联蛋白是必需的。泛素化蛋白由VCP/p97（酵母中为Cdc48）提取并呈递给蛋白酶体降解。任何RNA残余物应 readily 被Xrn1或细胞质外体降解。值得注意的是，RNF25和RNF14由GCN1招募到核糖体，GCN1最近作为碰撞核糖体的关键传感器出现。

**翻译非依赖性质量控制机制**

许多损伤RNA的物理和化学试剂也激活抑制翻译起始并最终促进多核糖体解离的应激通路。在没有扫描核糖体的情况下，可能需要替代的翻译非依赖性机制来识别和降解受损RNA。值得注意的是，翻译抑制允许广泛的RNA-RNA和RNA-蛋白质分子间相互作用，可导致细胞质中称为应激颗粒（SG）的液体样mRNA富集凝聚体的组装。

RNA结合蛋白YB-1或YBX1——哺乳动物Y-box结合蛋白家族的成员——似乎在SG动力学中发挥重要作用。此外，YB-1被认为对含8-oxoG的RNA具有更高的亲和力，但该因子在降解氧化RNA中的可能作用尚未被证实。同样，大肠杆菌多核苷酸磷酸化酶（PNPase）主要功能为RNA的3'→5'外切核酸酶降解，似乎对含8-oxoG的RNA具有特异性，并被提示在去除氧化RNA中可能发挥作用。确实，在HeLa细胞中敲低PNPase被发现导致氧化RNA的积累并使细胞对氧化应激敏感。

相比之下，AU富含元件RBP 1（AUF1；也称为hnRNP D）被认为优先结合含8-oxoG的mRNA。由于该蛋白已知与CCR4-NOT去腺苷酸酶复合物相互作用，AUF1结合氧化RNA被认为可能触发它们的快速降解。最后，更近的研究还鉴定了聚(rC)结合蛋白1（PCBP1）作为8-oxoG阅读蛋白。然而，与识别单个8-oxoG的AUF1不同，PCBP1与RNA的结合需要两个近距离定位的8-oxoG，这只能在高度破坏性的氧化应激下发生。因此，PCBP1与氧化RNA的结合被认为以某种方式负责氧化应激下的凋亡诱导。然而，所有这些RBP都在RNA代谢中建立了超出其假设的识别氧化RNA功能的作用。

**mRNA损伤中的信号传导**

虽然质量控制在生物学中普遍存在，并在去除缺陷分子方面发挥重要作用，但它们往往不足以维持细胞在应对化学和物理损伤时的稳态。对于细胞如何响应DNA损伤尤其如此。一方面，它们激活适当的DNA修复通路；但另一方面，如果损伤相对严重，它们通过蛋白激酶激活信号通路以阻滞细胞周期，并在必要时诱导细胞死亡。有趣的是，这些激酶的关键信号是DNA损伤本身，如ssDNA或dsDNA断裂的积累。

在令人兴奋的新报告中，几个团队发现生物体利用受损mRNA通过其对核糖体功能的影响来激活应激信号通路。这些过程允许细胞重编程基因表达并适应应激条件。更近的研究甚至确定受损RNA调控细胞命运并可在严重应激条件下触发凋亡。从这些研究中产生的是细胞仔细监测核糖体碰撞频率以激活适当反应的机制。

**整合应激反应（ISR)由受损mRNA响应的碰撞核糖体激活**

近50年来，已知真核生物通过激活ISR来全局调控蛋白质合成以响应应激。最初在哺乳动物细胞提取物中发现，eIF2α在血红素不可用、双链RNA存在或氧化应激时被蛋白激酶磷酸化。后来的酵母研究表明，该起始因子在缺乏氨基酸时也可被Gcn2磷酸化。eIF2α在丝氨酸51的磷酸化对前起始复合物（PIC）形成有深远影响，因为它使该蛋白成为其鸟嘌呤交换因子（GEF）eIF2B的竞争性抑制剂，有效限制起始tRNA三元复合物的浓度。因此，整体翻译输出被抑制；然而，在这些条件下，经历非典型起始机制的促生存mRNA（如酵母中的Gcn4和人类中的ATF4）被优先翻译。

现在已知哺乳动物有四个eIF2α激酶：PKR、HRI、GCN2和PERK，它们分别在ds-RNA、细胞质蛋白质错误折叠、核糖体碰撞和ER应激时被激活。在这些激酶中，GCN2是最广泛的，几乎存在于所有真核生物中。其激活模式在酵母中已被广泛研究，在酵母中它是唯一已知的eIF2α激酶。GCN2最初在氨基酸剥夺的背景下研究，特别是组氨酸饥饿。值得注意的是，对蛋白结构域结构的分析显示它具有类似于细菌RelA蛋白的组氨酰tRNA合成酶样（His-RS样）结构域，RelA通过产生警报素（p）ppGpp激活严格反应，抑制转录和翻译。RelA使用其Thr-RS样结构域感知核糖体A位上的脱酰tRNA，它们在氨基酸饥饿条件下积累。与ISR类似，严格反应也重编程基因表达；增加氨基酸生物合成、应激反应并抑制增殖。

尽管这个模型很吸引人，但它无法解释后来的观察，即Gcn2可以被不一定伴随脱酰tRNA积累的条件激活。在酵母中，烷基化和氧化剂如MMS和4-NQO分别触发Gcn2依赖性eIF2α磷酸化，而不伴随脱酰tRNA的明显增加。现在已知MMS和4-NQO损伤mRNA，抑制tRNA选择并最终导致核糖体碰撞。真菌中核糖体停滞与Gcn2激活之间的这种联系得到了改变tRNA修饰（减缓翻译）也导致Gcn2激活而不伴随脱酰tRNA水平明显增加的观察的支持。同时，揭示哺乳动物GCN2可以以脱酰tRNA非依赖性方式激活，其中小鼠神经元中tRNA的耗尽和核糖体拯救的抑制导致核糖体停滞和GCN2的eIF2α磷酸化。

后来的研究确定GCN2相对于脱酰tRNA更 robustly 被核糖体的P柄激活。应该指出的是，核糖体的这一区域在延伸过程中与三元复合物和eEF2相互作用。因此，它的可用性可能 poorly 与延伸因子相互作用的停滞核糖体发出信号。确实，抑制tRNA选择的抗生素的添加以及释放因子的耗尽也激活GCN2。这些观察被用于论证核糖体上的空A位是Gcn2激活所必需的，因为使核糖体停滞但保持该位点占据的化合物不激活该激酶。

停滞模型提出的Gcn2激活呈现了两个重要问题：1）该因子及其辅激活因子如何识别停滞的核糖体？2）细胞如何决定在面对停滞时激活ISR还是RQC。虽然尚未完全回答第一个问题，但多个团队的研究提供了令人信服的证据表明碰撞的核糖体激活Gcn2。与本综述相关，Green组和研究人员团队例如展示了UV、烷基化和氧化应激激活该激酶，并伴随RNase抗性二体结构的积累，这是核糖体碰撞的标志。此外，在药物中间浓度时观察到最佳的eIF2α磷酸化，这些浓度仅使部分核糖体停滞，导致广泛碰撞。

与这些观察一致，在冷冻电镜结构中，Wilson组显示Gcn2的辅激活因子Gcn1结合碰撞的核糖体。该非常大的蛋白使用其广泛的HEAT重复从碰撞的核糖体"蜿蜒"到停滞的核糖体上。尽管这些结构是Gcn2非活性构象的碰撞核糖体，但它们揭示了它们的结构如何作为Gcn1的平台，并在适当条件下潜在激活Gcn2。值得注意的是，来自同组的最近冷冻电镜研究揭示Gcn2可作为一种与核糖体60S亚基结合的非活性二聚体存在，独立于其辅激活因子，代表一种"待命"状态。然而，在细胞应激时，Gcn2迅速从60S亚基重新定位到碰撞的核糖体，这一过程需要其辅激活因子Gcn1或Gcn20。这一观察表明与60S亚基的结合可能作为平台，将GCN2定位以快速招募到碰撞的核糖体，从而能够快速激活ISR。

有人提出Gcn2激活可能有两种机制，一种是碰撞依赖性的，一种是碰撞非依赖性的，后者依赖于Gcn2结合脱酰tRNA的能力。然而，鉴于tRNA氨酰化的减少几乎总是导致核糖体碰撞，两种独立机制的进化似乎是不必要的。研究人员团队更近的数据提供了对碰撞依赖性模型的进一步支持，其中显示稳健的Gcn2激活需要额外因子Mbf1的存在。该蛋白结合碰撞的核糖体，结构研究揭示了其与碰撞和停滞核糖体相互作用的机制，并防止停滞诱导的移码。抑制Mbf1招募到碰撞核糖体的突变减少了所有测试条件下的Gcn2介导的eIF2α磷酸化，包括诱导RNA损伤和氨基酸饥饿的条件。最近的一项研究在GCN2激活被重组时提供了对核糖体中心激活模式的直接证据。仅在诱导核糖体碰撞时，氨基酸饥饿条件下才发生GCN2介导的eIF2α磷酸化，并且这一活性需要碰撞传感器GCN1的存在。

关于细胞如何决定激活RQC还是ISR的第二个问题，源于Guydosh组和研究人员团队的独立观察，显示酵母中HEL2的删除（因此废除RQC）导致ISR的增加激活。研究人员团队后来的数据显示，虽然RNA损伤导致两种通路的诱导，但抑制一个导致另一个的过度激活。应该指出的是，Hel2介导的核糖体蛋白泛素化似乎比Gcn2介导的eIF2α磷酸化对损伤水平更敏感，需要低得多的烷基化剂浓度才能实现稳健活性。先验地，能够解释这些观察的最简单模型是Hel2与Gcn2和/或其辅激活因子在碰撞核糖体上直接竞争。与该模型不一致的是，Hel2活性位点突变（不影响E3连接酶与核糖体之间的关联）增加了在无效突变体中观察到的Gcn2激活。同样，uS10中Hel2靶赖氨酸残基突变为精氨酸（抑制RQC）也导致ISR诱导增加类似表型。

**mRNA损伤通过激活核糖毒性应激反应（RSR）调控细胞命运**

ISR开始时是一个促生存通路，保存细胞资源并重编程基因表达以恢复稳态。然而，GCN2的激活也可能导致细胞周期停滞，甚至可诱导凋亡。应该指出的是，这似乎在应激条件持续时发生。核糖体功能上的应激条件往往一开始就如此严重，以至于细胞等待ISR阻滞细胞周期 ?